Korozyon ve Vitelline Membran Mekanik Kaldırma: Drosophila Oositleri Doğrudan Gözleme Hazırlama Yöntemi

- Bir tuzlu su çözeltisinde sabit yumurtalıklardan olgun oositlerle başlayın. Olgun oositler dış koroyon ve iç vitellin zarından oluşan yumurta kabukları taşır.

Korozyon ve vitellin zarını mekanik olarak çıkarmak için, oositleri önceden işlenmiş iki kaydırağın buzlu kısımları arasına yerleştirin.

Şimdi, oositleri başka bir yönde yuvarlamak için üst kaydırağı hafif bir açıyla hareket ettirin. Dairesel hareketten kaçınarak, üst slayt alt kaydırağa dik hareket edene kadar bu açıyı kısa artışlarla artırın. Bu hareket, korozyonları ve asale zarlarını mekanik olarak kaldırarak oosit içine problara veya lekelere erişim sağlar.

Korozyonsuz oositler uzun ve ince görünecek ve vitelline zarı olmayanlar sivri uçlara sahip olacaktır. Temizlenen oositleri çevredeki enkazdan ayırmak için, numune karışımını bir tüpe aktarın ve enkaz üstte yüzerken oositlerin dibe yerleşmesine izin verin ve çıkarılabilir.

Bu protokolde, olgun Drosophila oositlerinden korozyon ve vitellin zarlarını çıkaracağız.

- Geç aşama oositleri ayırmak için, önce sığ bir diseksiyon kabına 1 mililitre PBSBTx ekleyin. Daha sonra, sabit yumurtalıkları sığ yemeğe aktarmak için BSA kaplı uçlu bir P200 kullanın.

Geç aşama oositler yeterince ayrıldığında, tüm dokuyu 500 mikrolitrelik bir mikrofuge tüpüne aktarın.

Oosit haddeleme için hazırlanmak için, 200 mikrolitre PBSBTx ile derin kuyulu bir yemeği önceden ıslatın.

Üç buzlu cam kaydırak elde edin ve üç kenara kaydırın. Sonra, slaytların buzlu cam bölgelerini bir ve iki birlikte hafifçe ovalayın. Cam parçalarını çıkarmak için deiyonize suda durulayın ve tek kullanımlık bir mendille kurulayın. Bir slayta 50 mikrolitre PBSBTx ekleyerek ve bu bölgeyi diğer slaytla ovalayarak pbsbtx ile bir ve iki slaytın buzlu bölgelerini kaplayın. Sıvıyı tek kullanımlık bir mendille çıkarın ve slaytları bir ve iki slaytın buzlu bölgelerini bir ve iki slaytla temas halinde tutun.

Oositleri yuvarlamak için, önce PBSBTx'te bir P200 pipet ucunu önceden ıslatın ve mikrop tüpündeki oositleri yukarı ve aşağı pipetleme ile dağıtın. Oositleri içeren 50 mikrolitre sıvıyı slaytın buzlu cam kısmının ortasına aktarın.

Sıvının yüzey gerilimi iki buzlu cam bölgesi arasında bir sızdırmazlık oluşturana kadar iki kaydırağı yavaşça küt küt atın. Buzlu bölgeyi örtmek için yeterli sıvı olmalıdır, ancak hiçbiri dışarı sızmalıdır.

Oosit hareketlerinin ve ilerlemesinin kolay görselleştirilmesi için mikroskop altında gerçekleştirin. Yatay yönde birkaç hareket yaptıktan sonra, hareket açısını hafifçe değiştirin.. Birden fazla artışta, üst slayt ikinin hareketi başlangıç yönüne dik olana kadar bu açıyı kademeli olarak 90 dereceye çıkarın. Sıvıda boş konkordatoların görüleceğini ve konkordatolardan yoksun oositlerin daha uzun ve daha ince görüneceğini unutmayın.

- Oositleri yuvarlarken, yuvarlanma yönünün her zaman düz bir çizgide olduğundan ve asla dairesel bir hareket olmadığından emin olun.

- Çözelti hafif bulanıklaşana kadar yuvarlanmayı yaklaşık 7 ila 10 kez tekrarlayın. Oositlerin çoğunluğu vitelline zarlarını kaybetmiş gibi göründüğünde yuvarlanmayı durdurun.

Üst kaydırağı iki hafifçe kaldırın, köşelerinden birini alttaki buzlu bölgenin ortasına sürükleyin, böylece yuvarlanmış oositler buzlu bölgenin merkezinde birikir. Oositleri PBSBTx ile her iki slayttan PBSBTx içeren derin kuyu kabına durulayın.

Slaytları bir ve iki ultra saf suyla temizleyin. Tek kullanımlık bir mendille kurulayın ve sıfırlayın. Aynı genotipin tüm oositleri yuvarlanana kadar bu adımları tekrarlayın. Bu genellikle genotip başına üç ila dört tur yuvarlanma gerektirir.

Yuvarlandıktan sonra enkazı gidermek için, 15 mililitrelik konik bir tüpe 1 mililitre PBSBTx ekleyin. Tüpün kenarlarını kaplamak için sıvıyı döndürün. PBSBTx kaplı bir P1000 pipet ucu kullanarak, yuvarlanmış oositleri derin kuyu kabından 1 mililitre PBSBTx içeren konik tüpe aktarın.

Opak oositleri batarken görmek için konik tüpü koyu bir arka plana karşı tutun. Oositlerin dibe yerleşmesine izin ettikten sonra, enkaz içeren çözeltinin üst 2 mililitresini çıkarmak ve atmak için bir P1000 kullanın.

Toplam üç tur enkaz kaldırma için adımı tekrarladıktan sonra, oositleri orijinal 500 mikrolitre mikrobuj tüpüne geri aktarmak için PBSBTx kaplı bir P1000 pipet ucu kullanın.