Mechanische verwijdering van Chorion en Vitelline-membraan: een methode om Drosophila-oöcyten voor te bereiden op directe observatie

- Begin met rijpe oöcyten uit vaste eierstokken in een zoutoplossing. Volwassen oöcyten dragen eierschalen bestaande uit een buitenste chorion en een binnenste vitellinemembraan.

Om het chorion- en vitellinemembraan mechanisch te verwijderen, plaatst u de oöcyten tussen de berijpte delen van twee voorbehandelde dia's. Beweeg de bovenste dia in rechte heen-en-weer bewegingen om wrijving te creëren die de oöcyten rolt.

Beweeg nu de bovenste dia onder een lichte hoek om de oöcyten in een andere richting te rollen. Vermijd cirkelvormige beweging, verhoog deze hoek in korte stappen totdat de bovenste dia loodrecht op de onderste dia beweegt. Deze beweging verwijdert mechanisch de koraaltjes en vitellinemembranen, waardoor toegang voor sondes of vlekken in de oöcyt mogelijk is.

Oöcyten zonder chorionen zullen lang en dun lijken, en die zonder vitelline membranen zullen puntige uiteinden hebben. Om de ontruimde oöcyten van het omringende puin te scheiden, brengt u het monstermengsel over naar een buis en laat u de oöcyten naar de bodem bezinken terwijl het puin aan de bovenkant drijft en kan worden verwijderd.

In dit protocol verwijderen we chorion- en vitellinemembranen uit volwassen Drosophila-oöcyten.

- Om de late eicellen te scheiden, voeg je eerst 1 milliliter PBSBTx toe aan een ondiepe dissectieschaal. Gebruik vervolgens een P200 met een BSA-gecoate tip om vaste eierstokken in de ondiepe schaal over te brengen. Pipetteer de eierstokken op en neer met de met BSA gecoate pipetpunt om de volwassen oöcyten los te maken van de minder volwassen oöcyten.

Wanneer laat stadium oöcyten voldoende gescheiden zijn, breng dan al het weefsel over naar een 500-microliter microfuge buis. Verwijder overtollige vloeistof met een getrokken Pasteur pipet, waardoor er ongeveer 150 tot 200 microliter in de buis achterblijft.

Om te bereiden op het rollen van oöcyten, maak je een diep-goed gerecht met 200 microliter PBSBTx voor. Dek de schaal af en zet hem opzij.

Verkrijg drie matglazen dia's en zet dia drie opzij. Wrijf vervolgens voorzichtig de berijpte glasgebieden van dia's één en twee samen. Spoel ze af in gedeioneerd water om eventuele glasscherven te verwijderen en droog met een wegwerpdoekje. Bedek de berijpte gebieden van dia's één en twee met PBSBTx door 50 microliters PBSBTx aan één dia toe te voegen en wrijf dit gebied met de andere dia. Verwijder de vloeistof met een wegwerpdoekje en plaats de dia's onder een ontleedmicroscoop.

Om de oöcyten te rollen, moet u eerst een P200 pipetpunt in PBSBTx voorbesproeien en de oöcyten in de microfugebuis verspreiden door op en neer te pipetten. Breng 50 microliters vloeistof met de oöcyten over naar het midden van het matglazen deel van dia één. Til dia twee op om dit te doen.

Laat de glijbaan langzaam twee zakken totdat de oppervlaktespanning van de vloeistof een afdichting creëert tussen de twee berijpte glasgebieden. Er moet voldoende vloeistof zijn om het berijpte gebied te bedekken, maar geen enkele mag eruit sijpelen. Houd vervolgens de onderste schuif één op zijn plaats met de ene hand en gebruik de andere hand om de bovenste schuif twee heen en weer te bewegen in een horizontale richting, waarbij dia twee waterpas blijft en ondersteund op dia drie.

Voer uit onder een microscoop voor eenvoudige visualisatie van oöcytbewegingen en voortgang. Na een paar bewegingen in de horizontale richting, verandert u de bewegingshoek enigszins. In meerdere stappen verhoogt u deze hoek geleidelijk tot 90 graden totdat de beweging van de bovenste dia twee loodrecht op de startrichting staat. Merk op dat lege koraaltjes zichtbaar zijn in de vloeistof en dat oöcyten zonder koraal langer en dunner zullen lijken.

- Let er bij het rollen van de oöcyten op dat de rolrichting altijd in een rechte lijn is en nooit in een cirkelvormige beweging.

- Herhaal het rollen ongeveer 7 tot 10 keer totdat de oplossing enigszins troebel wordt. Stop met rollen wanneer de meeste oöcyten hun vitellinemembranen lijken te hebben verloren.

Til voorzichtig de bovenste dia twee op en sleep een van de hoeken naar het midden van het berijpte gebied aan de onderkant, zodat de gerolde oöcyten zich ophopen in het midden van het berijpte gebied. Spoel de oöcyten van beide dia's met PBSBTx in de diep-putschaal met PBSBTx.

Reinig dia's een en twee met ultrapure water. Droog met een wegwerpdoekje en reset. Herhaal deze stappen totdat alle oöcyten van hetzelfde genotype zijn gerold. Dit vereist meestal drie tot vier rollende ronden per genotype.

Om vuil na het rollen te verwijderen, voegt u 1 milliliter PBSBTx toe aan een conische buis van 15 milliliter. Wervel de vloeistof om de zijkanten van de buis te coaten. Breng met behulp van een PBSBTx-gecoate P1000 pipetpunt de gerolde oöcyten over van de diep-goed-schotel naar de conische buis met 1 milliliter PBSBTx. Voeg nog eens 2 milliliter PBSBTx toe aan de conische buis.

Houd de conische buis tegen een donkere achtergrond om de ondoorzichtige oöcyten te zien zinken. Nadat u de oöcyten naar de bodem hebt laten bezinken, gebruikt u een P1000 om de bovenste 2 milliliter oplossing met vuil te verwijderen en weg te gooien.

Na het herhalen van de stap voor in totaal drie rondes puinverwijdering, gebruikt u een PBSBTx-gecoate P1000 pipetpunt om de oöcyten terug te brengen naar de oorspronkelijke 500-microliter microfuge buis. 20 tot 25 vrouwtjes moeten ongeveer 50 microliter gerolde volwassen oöcyten opleveren.