Remoção mecânica da membrana de chorão e vitelline: um método para preparar oócitos de Drosophila para observação direta

- Comece com oócitos maduros de ovários fixos em uma solução salina. Oócitos maduros possuem cascas de ovos consistindo de um acorde externo e membrana vitelline interna.

Para remover mecanicamente o acorde e a membrana vitelline, coloque os oócitos entre as partes foscos de dois slides pré-tratados. Mova o slide superior em movimentos diretos de ida e volta para criar atritos que rolam os oócitos.

Agora, mova o slide superior em um pequeno ângulo para rolar os oócitos em outra direção. Evitando o movimento circular, aumente este ângulo em pequenos incrementos até que o slide superior se mova perpendicularmente para o slide inferior. Este movimento remove mecanicamente os acordes e membranas vitelinas, permitindo o acesso para sondas ou manchas no oócito.

Os oócitos sem corões aparecerão longos e finos, e aqueles sem membranas vitelline terão extremidades pontiagudas. Para separar os oócitos limpos dos detritos circundantes, transfira a mistura de amostras para um tubo, e permitir que os oócitos se instalem até o fundo enquanto os detritos flutuam no topo e podem ser removidos.

Neste protocolo, removeremos membranas de corão e vitelline de oócitos maduros de Drosophila.

- Para separar os oócitos em estágio final, primeiro, adicione 1 mililitro de PBSBTx a um prato de dissecação rasa. Em seguida, use um P200 com uma ponta revestida de BSA para transferir ovários fixos para o prato raso. Pipeta os ovários para cima e para baixo com a ponta pipeta revestida de BSA para desalojar os oócitos maduros dos oócitos menos maduros.

Quando os oócitos em estágio final estiverem suficientemente separados, transfira todo o tecido para um tubo de microfuge de 500 microfísicos. Remova o excesso de líquido com uma pipeta Pasteur puxada, deixando cerca de 150 a 200 microlitres no tubo.

Para se preparar para oocito rolando, pré-molhado um prato profundo-bem com 200 microliters de PBSBTx. Cubra o prato e reserve-o.

Obtenha três lâminas de vidro foscos e reserve três slides. Em seguida, esfregue suavemente as regiões de vidro fosco dos slides um e dois juntos. Cubra as regiões foscas dos slides um e dois com PBSBTx adicionando 50 microlitros de PBSBTx a um slide e esfregando esta região com o outro slide. Remova o líquido com um lenço descartável e coloque os slides sob um microscópio dissecando. Mantenha as regiões foscas de slides um e dois em contato com slide três slides de suporte dois.

Para enrolar os oócitos, primeiro, pré-molhar uma ponta de pipeta P200 em PBSBTx e dispersar os oócitos no tubo de microfuge por tubulação para cima e para baixo. Transfira 50 microliters de líquido contendo os oócitos para o centro da parte de vidro fosco do slide um. Levante dois para fazer isso.

Abaixe lentamente dois até que a tensão superficial do líquido crie uma vedação entre as duas regiões de vidro fosco. Deve haver líquido suficiente para cobrir a área fosco, mas nenhum deve estar vazando. Em seguida, segure o slide inferior no lugar com uma mão e use a outra mão para mover o slide superior dois para frente e para trás em uma direção horizontal, mantendo o deslizamento de dois níveis e apoiado no slide três.

Executar sob um microscópio para fácil visualização dos movimentos e progresso do oócito. Após alguns movimentos na direção horizontal, altere ligeiramente o ângulo de movimento. Em múltiplos incrementos, aumente gradualmente esse ângulo para 90 graus até que o movimento do slide superior dois seja perpendicular à direção inicial. Note que acordes vazios serão visíveis no líquido, e os oócitos sem acordes aparecerão mais e mais finos.

- Ao rodar os oócitos, certifique-se de que a direção de rolagem está sempre em linha reta e nunca em um movimento circular.

- Repita o rolamento cerca de 7 a 10 vezes até que a solução fique ligeiramente nublada. Pare de rolar quando a maioria dos oócitos parece ter perdido suas membranas vitelline.

Levante suavemente o slide superior dois, arrastando um de seus cantos para o centro da região fosca no slide inferior um de modo que os oócitos laminados se acumulam no centro da região fosca. Enxágüe os oócitos de ambos os slides com PBSBTx no prato de poço profundo contendo PBSBTx.

Lâminas limpas um e dois com água ultrauso. Seque com um lenço descartável e reinicie. Repita estes passos até que todos os oócitos do mesmo genótipo tenham sido enrolados.

Para remover detritos após o rolamento, adicione 1 mililitro PBSBTx a um tubo cônico de 15 mililitros. Gire o líquido para revestir as laterais do tubo. Utilizando uma ponta de pipeta P1000 revestida de PBSBTx, transfira os oócitos laminados do prato de poço profundo para o tubo cônico contendo 1 mililitro de PBSBTx. Adicione mais 2 mililitros de PBSBTx ao tubo cônico contendo os oócitos.

Segure o tubo cônico contra um fundo escuro para ver os oócitos opacos enquanto afundam. Depois de deixar os oócitos se acomodarem até o fundo, use um P1000 para remover os 2 mililitros superiores da solução contendo detritos e descarte.

Depois de repetir o passo para um total de três rodadas de remoção de detritos, use uma ponta de pipeta P1000 revestida de PBSBTx para transferir os oócitos de volta para o tubo original de microfuge de 500 microlitres.