Drosophila Late Pupa Indirect Flight Muscle (IFM) Dissection: A Method for High-Throughput Tissue Collection

- In der Erwachsenenfliege sind die indirekten Flugmuskeln oder IFMs die größten Muskeln der Fliege, die den gesamten Thorax überspannt. Die IFMs orchestrieren die charakteristischen Hochfrequenz-Flügelbewegungen in zweiflügeligen Fliegen, einschließlich Drosophila. Zwei gegensätzliche Muskelfasergruppen bilden die IFMs.

Erstens befinden sich die dorsalen Längsmuskeln, oder DLMs, entlang der Medianebene des Thorax über dem Darm und spannen sich von vorder nach hinten. Zweitens erstrecken sich die dorsalen ventralen Muskeln, oder DVMs, von oben bis zum Boden des Thorax und werden vom TDT oder Sprungmuskel flankiert.

Bis etwa 48 Stunden nach der Pupariumbildung oder APF können reifende IFMs visuell mit einem einfachen Seziermikroskop identifiziert werden. Im Beispielprotokoll werden wir IFMs von Pupae absammeln, die älter als 48 Stunden APF sind, um eine Analyse mit hohem Durchsatz durchzuführen.

- Für DIE IFM-Sektion nach 48 Stunden APF, verwenden Sie einen leicht benetzten Pinsel, um die inszenierten Welpen auf einen Streifen aus doppelseitigem Klebeband auf einem Mikroskopschlitten zu übertragen. Richten Sie die Pupillen in einer Linie, ventrale Seite nach unten und vorderin in Richtung der Unterseite der Rutsche. Wenn alle Pupae platziert wurden, verwenden Sie Zangen, um auseinander zu necken und öffnen Sie das erste Pupal-Gehäuse über den vorderen Spiracles, und schieben Sie sanft ein Paar Zangen dorsal in Richtung des Hinterteils, schneiden Sie das Pupal-Gehäuse, während sich die Zange bewegt.

Befreien Sie die Pupa aus dem geöffneten Gehäuse, und übertragen Sie die Pupa sofort auf einen Tropfen PBS auf einem zweiten Mikroskop-Dia. Wenn alle Pupae befreit sind, verwenden Sie eine feine Schere, um den Bauch der Pupae vom Thorax wegzuschneiden und die Bauchmuskeln in einen separaten Haufen zu schieben. Wenn alle Thoraxe entfernt wurden, verwenden Sie ein Stück Tissuepapier, um den Großteil der PBS zu entfernen.

Fügen Sie einen Tropfen frisch gekühlten PBS zu den verbleibenden Thoraxen hinzu, bevor Sie die Schere verwenden, um vom Kopf entlang der Längskörperachse in einer einzigen Bewegung zu schneiden, um den Thorax in die Hälfte zu teilen. Wenn alle Pupas seziert wurden, verwenden Sie die Nummer fünf Zangen, um eine der Halbierungen auszuwählen und sanft die Spitzen einer Zange über und unter der Mitte der IFMs einzufügen.

Halten Sie das erste Zangenpaar still, verwenden Sie eine feine Schere, um ein Ende des IFM von der Nagelhaut und den Sehnen weg zu schneiden, bevor Sie den Pupa um 180 Grad drehen, damit das andere Ende des IFM frei von der Nagelhaut und den Sehnen geschnitten werden kann. Verwenden Sie Zangen, um das IFM-Bündel vom Thorax an den Rand der PBS-Blase zu übertragen, um das Bündel an Ort und Stelle zu halten.

Dann schieben Sie den Kadaver auf die gegenüberliegende Seite der Rutsche und sezieren Sie den Rest der IFMs auf die gleiche Weise. Wenn alle IFMs gesammelt wurden, verwenden Sie die Nummer fünf Zangen, um alle Sprungmuskel- oder Nagelfragmente zu entfernen, die ihren Weg in die Proben gefunden haben könnten. Verwenden Sie dann Wasserspannung, um die sezierten IFMs sanft zwischen einem Paar Zangen zu erfassen und die IFMs in ein 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr mit 250 Mikrolitergekühlten PBS zu legen.