دروسوفيلا في فيفو تصوير الكالسيوم: طريقة للتصوير الوظيفي لنشاط الخلايا العصبية

- لإجراء تصوير الكالسيوم في الجسم الحي في الجهاز العصبي Drosophila، واستهداف التعبير عن مؤشر الكالسيوم المشفرة وراثيا، مثل GCaMP، إلى الخلايا العصبية ذات الاهتمام.

GCaMP هو بروتين الانصهار الذي يتم فيه تعديل البروتين الفلوري الأخضر المعزز ، أو EGFP ، ودمجه في جزء M13 من سلسلة ضوء الميوسين في N-terminus ، والبروتين الملزم للكالسيوم ، كالمودولين ، في C-terminus. يرتبط الكالسيوم بالكالمودولين ، ويثير تغييرات في تشكيل GCaMP ، مما يسبب زيادة في فلورية البروتين.

لتصوير التغيرات في مضان GCaMP كوكيل لنشاط الخلايا العصبية في الجسم الحي ، وفضح منطقة الجهاز العصبي مع النشاط المتوقع.

في بروتوكول المثال ، سنرى التصوير الوظيفي GCaMP يستخدم لتصور الاستجابات في أجسام الفطر في الدماغ أثناء التعلم النقابي الشمي.

- لتصور مؤشرات الكالسيوم المستندة إلى GFP، قم بضبط ليزر مجهر متعدد الفوتون مجهز بالليزر بالأشعة تحت الحمراء وهدف غمر المياه، مثبتة على طاولة معزولة الاهتزاز، إلى الطول الموجي الإثارة من 920 نانومتر، وتثبيت مرشح ممر باندباس GFP. باستخدام مقبض التكيف Z الخشنة، والمسح الضوئي من خلال محور z من الدماغ لتحديد موقع منطقة الدماغ من الفائدة. الحجم إلى 512 في 512 بكسل وحدد المنطقة التي سيتم مسحها ضوئيا ، مع الأخذ في الاعتبار وقت المسح المحسوب لكل إطار لتحقيق معدل إطار لا يقل عن 4 Hertz.

بالنسبة للتصور العابر للكالسيوم الذي تثيره الرائحة ، ابدأ حزمة ماكرو مبرمجة مسبقا قادرة على ربط برنامج الحصول على الصورة وبرنامج توصيل الرائحة وابدأ القياس في برنامج المجهر لمدة 6.25 ثانية لإنشاء قيمة خط الأساس F0. في نظام توصيل الرائحة ، قدم حافزا للرائحة لمدة 2.5 ثانية ، يشار إليه هنا بإضاءة المصابيح ، الناجمة عن فتح وإغلاق صمامات محددة لكأس الرائحة ، تليها 12.5 ثانية من التسجيل في نهاية تعويض الرائحة.

لإجراء تكييف اقتراني في هذا الإعداد، استخدم نظام توصيل الرائحة الذي يتم التحكم فيه بواسطة الكمبيوتر لتقديم التحفيز المكيف بالإضافة إلى الرائحة لمدة 60 ثانية، جنبا إلى جنب مع 12 90 فولت الصدمات الكهربائية. بعد استراحة 60 ثانية، وتقديم شرط التحفيز ناقص رائحة وحدها لمدة 60 ثانية دون صدمة كهربائية.