Drosophila I Vivo Calcium Imaging: En metode til funktionel billeddannelse af neuronal aktivitet

- At udføre in vivo calcium imaging i Drosophila nervesystemet, målrette udtrykket af en genetisk kodet calcium indikator, såsom GCaMP, til neuroner af interesse. Når neuroner brand en handling potentiale, hurtig depolarisering af membranen forårsager spænding-gated calcium kanaler til at åbne, hvilket fører til en tilstrømning af ekstracellulær calcium ind i cellen.

GCaMP er et fusionsprotein, hvor forbedret grønt fluorescerende protein, eller EGFP, modificeres og smeltes til M13-fragmentet i myosinlyskæden ved N-endestationen og til det calciumbindende protein, calmodulin, ved C-endestationen. Calcium binder sig til calmodulin, udløser kropsbygningsændringer i GCaMP, hvilket forårsager en stigning i proteinets fluorescens.

Til billedændringer i GCaMP fluorescens som en proxy for neuronal aktivitet in vivo, udsætte regionen af nervesystemet med forventet aktivitet. Derefter bruge en fluorescerende mikroskop, der kan fange GCaMP dynamik og er udstyret med en stimulus levering setup. Levere stimulus, for eksempel en lugt, mens du optager GCaMP fluorescens i reagerende neuroner.

I eksempelprotokollen vil vi se GCaMP funktionel billeddannelse blive brugt til at visualisere reaktioner i hjernens svampelegemer under olfaktorisk associativ læring.

- Til visualisering af de GFP-baserede calciumindikatorer indstilles laseren af et multifotonmikroskop udstyret med en infrarød laser og et mål for nedsænkning af vand installeret på en vibration isoleret bord, til en excitation bølgelængde på 920 nanometer, og installere en GFP bandpass filter. Brug den grove Z justering knop, scanne gennem z-aksen i hjernen for at finde hjernen region af interesse. Brug afgrøden funktion til at fokusere scanningen på kun det område af interesse for at minimere scanning tid, og rotere scanningen opfattelse sådan, at den forreste del af hovedet vender nedad. til 512 pixel og vælg det område, der skal scannes, under hensyntagen til den beregnede scanningstid for hver ramme for at opnå en billedhastighed på mindst 4 Hertz.

For lugt-fremkaldt calcium forbigående visualisering, indlede en forprogrammeret makro pakke i stand til at forbinde billedet erhvervelse software og lugt levering program og begynde målingen i mikroskop software i 6,25 sekunder til at etablere en F0 baseline værdi. I lugt levering system, levere en 2,5 sekunder lugt stimulus, angivet her ved belysning af lysdioder, udløst af åbning og lukning af specifikke lugt kop ventiler, efterfulgt af 12,5 sekunders optagelse i slutningen af lugten offset. Derefter gentage levering for en anden og tredje lugtstof på samme måde.

For at udføre associativ konditionering i denne opsætning skal du bruge det computerstyrede lugtleveringssystem til at præsentere den betingede stimulus plus lugt i 60 sekunder, sammen med 12 90-volt elektriske stød. Efter en 60 sekunder pause, præsentere tilstanden stimulus minus lugt alene i 60 sekunder uden elektrisk stød. Mål post-uddannelse lugt-fremkaldt calcium transienter igen ved at gentage pre-uddannelse lugt stimulation protokol 3 minutter efter endt uddannelse fase. Derefter gemme billedbehandling filer i et passende format til senere billedanalyse.