Drosophila In Vivo Calcium imaging: een methode voor functionele beeldvorming van neuronale activiteit

- Om in vivo calciumbeeldvorming in het Drosophila-zenuwstelsel uit te voeren, richt u zich op de expressie van een genetisch gecodeerde calciumindicator, zoals GCaMP, op de neuronen van belang. Wanneer neuronen een actiepotentiaal afvuren, zorgt een snelle depolarisatie van het membraan ervoor dat spanningsge gated calciumkanalen openen, wat leidt tot een instroom van extracellulair calcium in de cel.

GCaMP is een fusie-eiwit waarin verbeterde groene fluorescerende eiwitten, of EGFP, worden gewijzigd en versmolten met het M13-fragment van de myosinelichtketen op het N-eindpunt, en met het calciumbindende eiwit calmodulin, aan het C-eindpunt. Calcium bindt aan calmodulin, veroorzaakt conformatieveranderingen in GCaMP, waardoor de fluorescentie van het eiwit toeneemt.

Om veranderingen in de GCaMP-fluorescentie in beeld te brengen als een proxy voor neuronale activiteit in vivo, stelt u het gebied van het zenuwstelsel bloot met verwachte activiteit. Gebruik vervolgens een fluorescerende microscoop die de GCaMP-dynamiek kan vastleggen en is uitgerust met een stimulusleveringsopstelling. Lever de stimulus, bijvoorbeeld een geur, terwijl u GCaMP-fluorescentie registreert in reagerende neuronen.

In het voorbeeldprotocol zullen we zien dat GCaMP functionele beeldvorming wordt gebruikt om reacties in de paddestoellichamen van de hersenen te visualiseren tijdens reukassociatie.

- Voor visualisatie van de op GFP gebaseerde calciumindicatoren stemt u de laser van een multifotonmicroscoop uitgerust met een infraroodlaser en een wateronderdompelingsobject, geïnstalleerd op een trillingsgeïdegreneerde tabel, af op een excitatiegolflengte van 920 nanometer en installeert u een GFP-bandpassfilter. Scan met behulp van de grove Z-instelknop door de z-as van de hersenen om het interessegebied van de hersenen te lokaliseren. grootte tot 512 bij 512 pixels en selecteer het te scannen gebied, rekening houdend met de berekende scantijd voor elk frame om een framesnelheid van ten minste 4 Hertz te bereiken.

Voor geur-opgeroepen calcium voorbijgaande visualisatie, start een voorgeprogrammeerd macropakket dat in staat is om de beeldverwervingssoftware en het geurafgifteprogramma te koppelen en begin de meting in de microscoopsoftware gedurende 6,25 seconden om een F0-basiswaarde vast te stellen. In het geurafgiftesysteem levert u een geurprikkel van 2,5 seconde, hier aangegeven door verlichting van LED's, geactiveerd door het openen en sluiten van specifieke geurbekerkleppen, gevolgd door 12,5 seconden opname aan het einde van de geurcompensatie.

Om associatieve conditionering in deze opstelling uit te voeren, gebruikt u het computergestuurde geurafgiftesysteem om de geconditioneerde stimulus plus geur gedurende 60 seconden te presenteren, naast 12 elektrische schokken van 90 volt. Na een pauze van 60 seconden presenteert u de conditieprikkel minus geur alleen gedurende 60 seconden zonder elektrische schok. Meet de na-training geur-opgeroepen calcium transiënten opnieuw door het pre-training geurstimulatieprotocol 3 minuten na het voltooien van de trainingsfase te herhalen.