Drosophila In Vivo Calcium Imaging: Eine Methode zur funktionellen Bildgebung der neuronalen Aktivität

- Um in vivo Kalzium-Bildgebung im Drosophila-Nervensystem durchzuführen, zielen Sie auf die Expression eines genetisch kodierten Kalziumindikators wie GCaMP auf die Neuronen von Interesse ab. Wenn Neuronen ein Aktionspotential abfeuern, führt eine schnelle Depolarisation der Membran zu spannungsgebundenen Kalziumkanälen, was zu einem Zustrom von extrazellulärem Kalzium in die Zelle führt.

GCaMP ist ein Fusionsprotein, bei dem verbessertes grünes fluoreszierendes Protein (EGFP) modifiziert und mit dem M13-Fragment der Myosin-Lichtkette am N-Terminus und dem Calcium-bindenden Protein Calmodulin am C-Terminus verschmolzen wird. Calcium bindet an Calmodulin, löst Konformationsänderungen in GCaMP aus, was zu einer Erhöhung der Fluoreszenz des Proteins führt.

Um Bildänderungen in der GCaMP-Fluoreszenz als Proxy für neuronale Aktivität in vivo zu zeigen, setzen Sie die Region des Nervensystems mit erwarteter Aktivität aus. Verwenden Sie dann ein Fluoreszenzmikroskop, das die GCaMP-Dynamik erfassen kann und mit einem Stimulus-Bereitstellungs-Setup ausgestattet ist. Liefern Sie den Reiz, zum Beispiel einen Geruch, während Sie GCaMP-Fluoreszenz in reagierenden Neuronen aufzeichnen.

Im Beispielprotokoll werden wir sehen, wie GCaMP funktionelle Bildgebung verwendet wird, um Reaktionen in den Pilzkörpern des Gehirns während des olfaktorischen assoziativen Lernens zu visualisieren.

- Für die Visualisierung der GFP-basierten Calciumindikatoren, stimmen Sie den Laser eines Multiphotonenmikroskops mit einem Infrarotlaser und einem Wassertauchobjektiv, auf einem vibrationsisolierten Tisch auf eine Anregungswellenlänge von 920 Nanometern installiert, und installieren Sie einen GFP-Bandpassfilter. Scannen Sie mit dem groben Z-Einstellknopf durch die Z-Achse des Gehirns, um den von Interesse entfernten Hirnbereich zu lokalisieren. Verwenden Sie die Erntefunktion, um das Scannen nur auf den Interessenbereich zu fokussieren, um die Scanzeit zu minimieren, und drehen Sie die Scanansicht so, dass der Vorderteil des Kopfes nach unten zeigt. Größe auf 512 x 512 Pixel und wählen Sie den zu scannenden Bereich aus, wobei die berechnete Scanzeit für jeden Frame berücksichtigt wird, um eine Bildrate von mindestens 4 Hertz zu erreichen.

Für die geruchsbeschworene Kalziumtransientenvisualisierung initiieren Sie ein vorprogrammiertes Makropaket, das die Bildaufnahmesoftware mit dem Geruchsabgabeprogramm verbinden kann, und beginnen Sie 6,25 Sekunden lang mit der Messung in der Mikroskopsoftware, um einen F0-Basiswert festzulegen. Liefern Sie im Geruchsabgabesystem einen 2,5-Sekunden-Geruchsreiz, der hier durch Beleuchtung von LEDs angezeigt wird, ausgelöst durch das Öffnen und Schließen bestimmter Geruchsbecherventile, gefolgt von 12,5 Sekunden Aufnahme am Ende des Geruchsversatzes. Wiederholen Sie dann die Lieferung für ein zweites und drittes Geruchsmittel auf die gleiche Weise.

Um assoziative Konditionierungen in diesem Setup durchzuführen, Verwenden Sie das computergesteuerte Geruchsabgabesystem, um den konditionierten Reiz plus Geruch für 60 Sekunden zu präsentieren, zusammen mit 12 90-Volt-Elektroschocks. Nach einer 60-Sekunden-Pause stellen Sie den Zustandsreiz minus Geruch allein für 60 Sekunden ohne Stromschlag dar. Messen Sie die nach dem Training geruchsevokierten Kalziumtransienten erneut, indem Sie das Vortraining-Geruchsstimulationsprotokoll 3 Minuten nach Abschluss der Trainingsphase wiederholen.