Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- For å utføre in vivo kalsiumavbildning i Drosophila-nervesystemet, målrette uttrykket av en genetisk kodet kalsiumindikator, som GCaMP, til nevronene av interesse. Når nevroner avfyrer et handlingspotensial, fører rask depolarisering av membranen til at spenningsporterte kalsiumkanaler åpnes, noe som fører til en tilstrømning av ekstracellulært kalsium i cellen.
GCaMP er et fusjonsprotein der forbedret grønt fluorescerende protein, eller EGFP, modifiseres og smeltes sammen til M13-fragmentet i myosinlyskjeden ved N-terminus, og til kalsiumbindende protein, calmodulin, ved C-terminus. Kalsium binder seg til calmodulin, utløser konformasjonsendringer i GCaMP, noe som forårsaker en økning i proteinets fluorescens.
For bildeendringer i GCaMP fluorescens som proxy for nevronal aktivitet in vivo, eksponere nervesystemet med forventet aktivitet. Bruk deretter et fluorescerende mikroskop som kan fange GCaMP-dynamikken og er utstyrt med et stimulusleveringsoppsett. Lever stimulansen, for eksempel en lukt, mens du registrerer GCaMP-fluorescens i responderende nevroner.
I eksempelprotokollen vil vi se at GCaMP funksjonell avbildning brukes til å visualisere responsen i hjernens sopplegemer under olfaktorisk assosiativ læring.
- For visualisering av GFP-baserte kalsiumindikatorer, juster laseren til et multifotonmikroskop utstyrt med en infrarød laser og et vanninnlevelsesmål, installert på et vibrasjonsisolert bord, til en eksitasjonsbølgelengde på 920 nanometer, og installer et GFP-båndpassfilter. Bruk den grove Z-justeringsknappen, skann gjennom z-aksen i hjernen for å finne hjerneområdet av interesse. Bruk beskjæringsfunksjonen til å fokusere skanningen på bare det interesseområdet for å minimere skannetiden, og roter skannevisningen slik at fremre hodet vender nedover. størrelse til 512 x 512 piksler og velg området som skal skannes, med tanke på beregnet skannetid for hvert bilde for å oppnå en bildefrekvens på minst 4 Hertz.
For luktindusert kalsium forbigående visualisering, start en forhåndsprogrammert makropakke som er i stand til å koble bildeinnsamlingsprogramvaren og luktleveringsprogrammet og begynne målingen i mikroskopprogramvaren i 6,25 sekunder for å etablere en F0-basisverdi. I luktleveringssystemet, lever en 2,5 sekunders lukt stimulus, angitt her ved belysning av lysdioder, utløst av åpning og lukking av spesifikke luktkoppventiler, etterfulgt av 12,5 sekunders opptak på slutten av luktforskyvningen. Gjenta deretter leveransen for en andre og tredje luktant på samme måte.
For å utføre assosiativ kondisjonering i dette oppsettet, bruk det datastyrte luktleveringssystemet for å presentere den betingede stimulansen pluss lukt i 60 sekunder, ved siden av 12 90-volts elektriske støt. Etter en 60 sekunders pause, presenter tilstandsstimulansen minus lukt alene i 60 sekunder uten elektrisk støt. Mål lukt-fremkalte kalsiumtransienter etter trening igjen ved å gjenta pre-trening luktstimuleringsprotokollen 3 minutter etter at du er ferdig med treningsfasen. Deretter lagrer du bildefilene i et passende format for senere bildeanalyse.
