Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Overførsel vasket C. eleganer i væske på et glas dias tidligere belagt med poly-lysin, en forbindelse, der vil hjælpe orm neglebånd holde sig til glasoverfladen. Tryk forsigtigt et andet glas dias lige ned med en kant overhængende den nederste dias. At immobilisere orme uden skader, komprimere dyrene undgå laterale bevægelser. Derefter placere glasrutschebaner med klemt orme på en metalblok inde i en isoleret laboratoriebeholder fyldt med et frysemiddel, såsom flydende nitrogen eller tøris.
Metal er en effektiv temperaturleder, der sikrer, at blokoverfladen er kold nok til hurtigt at fryse ormens neglebånd til begge glasoverflader. Når frosset, hurtigt adskille glasset dias til at trække fra hinanden eller knæk åbne ormen neglebånd. Fortsæt med væv fiksering og farvning som afbrydelse af den lave permeabilitet kutikula giver kemiske fikseringsmidler og farvning antistoffer at få adgang til den indvendige orm væv. I den følgende protokol, vil vi se en detaljeret demonstration af fryse-krakning teknik og væv fiksering.
- Først forberede et dias til at fastsætte orme. Pipette 30 mikroliter af poly-L-lysin på et dias, ennd derefter indstille en anden dias på den anden og gniddem sammen for at sprede opløsningen jævnt på begge. Nu skal du skrælle de to dias og lad dem lufttørre i 30 minutter.
Placer derefter en flad metalblok i en beholder fyldt med flydende nitrogen. Vask pladerne med M9-opløsning og overfør ca. 10 mikroliter M9, der indeholder ormene.
Når ormene er overført, forsigtigt slippe en coverslip crossways på dem, således at coverslip udhæng en kant. Derefter forsigtigt trykke på coverslip uden at gøre nogen laterale bevægelser.
Overfør nu straks rutsjebanen til metalblokken i flydende nitrogen og lad den fryse. Efter fem minutter skal du svirpe dækslet af ved hjælp af den overhængende kant. Gør dette hurtigt for at få den rigtige revne i neglebåndet.
Dernæst nedsænke dias i en methanol-fyldt glas Coplin krukke på minus 20 grader Celsius. Efter fem minutter, overføre dias til en acetone-fyldt glas Coplin krukke i yderligere fem minutter ved samme temperatur.
