Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Encyclopedia of Experiments
Encyclopedia of Experiments: Biology

A subscription to JoVE is required to view this content.

Freeze-Cracking van nematoden

 
Click here for the English version

Freeze-Cracking van nematoden: een methode om inwendige wormweefsels bloot te leggen voor vlekken

Article

Transcript

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

- Breng gewassen C. elegans in vloeistof over op een glazen glijbaan die eerder was bedekt met polylysine, een verbinding die worm cuticula's aan het glasoppervlak zal helpen plakken. Druk voorzichtig een andere glasschuif recht naar beneden met een rand die de onderste glijbaan overhangt. Om de wormen zonder schade te immobiliseren, comprimeert u de dieren om zijdelingse bewegingen te vermijden. Plaats vervolgens de glazen dia's met ingeklemde wormen op een metalen blok in een geïsoleerde laboratoriumcontainer gevuld met een vriesmiddel, zoals vloeibare stikstof of droogijs.

Metaal is een effectieve temperatuurgeleider die ervoor zorgt dat het blokoppervlak koud genoeg is om de nagelriemen van de worm snel op beide glasoppervlakken te bevriezen. Eenmaal bevroren, scheidt u snel de glasglijbanen om de wormriemen uit elkaar te trekken of open te breken. Ga verder met weefselfixatie en kleuring, omdat verstoring van de cuticula met lage permeabiliteit chemische fixatieven en kleuringsantistoffen toegang geeft tot de binnenste wormweefsels. In het volgende protocol zullen we een gedetailleerde demonstratie zien van de vries-scheurtechniek en weefselfixatie.

- Maak eerst een glijbaan klaar om de wormen te fixeren. Pipetteer 30 microliters poly-L-lysine op een glijbaan, eennd vervolgens, zet een tweede dia op de andere en wrijfze samen om de oplossing gelijkmatig over beide te verspreiden. Schil nu de twee dia's uit elkaar en laat ze 30 minuten aan de lucht drogen.  

Plaats vervolgens een plat metalen blok in een container gevuld met vloeibare stikstof. Was de platen met M9-oplossing en breng ongeveer 10 microliters M9 met de wormen over. U kunt ook de wormen plukken en M9 aan de dia toevoegen.

Zodra de wormen zijn overgedragen, laat u voorzichtig een afdeklip kruisend op hen vallen, zodat de afdeklip een rand overhangt. Druk vervolgens voorzichtig op de afdeklip zonder zijdelingse bewegingen te maken.

Breng nu de schuif onmiddellijk over op het metalen blok in vloeibare stikstof en laat het bevriezen. Veeg na vijf minuten de afdeklip af met behulp van de overhangende rand. Doe dit snel om de juiste scheur van de nagelriem te krijgen.

Dompel vervolgens de glijbaan onder in een methanolgevulde glazen Coplin pot bij min 20 graden Celsius. Breng de glijbaan na vijf minuten over in een met acetongevuld glazen Coplin pot voor nog eens vijf minuten bij dezelfde temperatuur. De dia's kunnen direct worden gekleurd of worden bewaard bij min 20 graden Celsius.

Tags

Lege waarde probleem
Read Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter