Freeze-Cracking von Nematoden: Eine Methode zur Belichtung von inneren Wurmgeweben für die Färbung

- Transfer gewaschen C. ELegans in Flüssigkeit auf einem Glasschlitten, der zuvor mit Polylysin beschichtet war, einer Verbindung, die helfen wird, Wurmkuläuse an der Glasoberfläche zu kleben. Drücken Sie vorsichtig einen weiteren Glasschlitten gerade nach unten mit einer Kante, die den unteren Schlitten überragt. Um die Würmer unbeschadet zu immobilisieren, komprimieren Sie die Tiere, um seitliche Bewegungen zu vermeiden.

Metall ist ein effektiver Temperaturleiter, der sicherstellt, dass die Blockoberfläche kalt genug ist, um die Nagelhaut des Wurms schnell auf beide Glasoberflächen einzufrieren. Sobald es gefroren ist, trennen Sie die Glasgleitet schnell, um die Wurm-Cuticles auseinanderzuziehen oder zu knacken.

- Zuerst bereiten Sie eine Folie vor, um die Würmer zu fixieren. Pipette 30 Mikroliter Poly-L-Lysin auf einem Dia, einnd dann, stellen Sie eine zweite Rutsche auf die andere und reibenSie sie zusammen, um die Lösung gleichmäßig auf beide zu verteilen. Jetzt schälen Sie die beiden Dias auseinander und lassen Sie sie für 30 Minuten an der Luft trocknen.  

Als nächstes legen Sie einen flachen Metallblock in einen mit flüssigem Stickstoff gefüllten Behälter. Waschen Sie die Platten mit M9-Lösung und übertragen Sie etwa 10 Mikroliter M9 mit den Würmern. Alternativ wählen Sie die Würmer aus und fügen Sie M9 zum Schlitten hinzu.

Sobald die Würmer übertragen sind, lassen Sie vorsichtig einen Deckelrutsch quer auf sie fallen, so dass der Deckelrutsch eine Kante überragt. Drücken Sie dann vorsichtig den Deckelschlupf, ohne seitliche Bewegungen zu machen.

Nun den Schlitten sofort in flüssigen Stickstoff auf den Metallblock übertragen und einfrieren lassen. Nach fünf Minuten mit der überhängenden Kante den Deckelabrutschen abstreifen.

Als nächstes tauchen Sie die Rutsche in ein Methanol-gefülltes Glas Coplin Glas bei minus 20 Grad Celsius. Nach fünf Minuten, übertragen Sie die Rutsche auf ein Aceton-gefülltes Glas Coplin Glas für weitere fünf Minuten bei der gleichen Temperatur. Die Dias können direkt gebeizt oder bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden.