Encyclopedia of Experiments: Biology
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- Transferência lavada C. elegans em líquido em um deslizamento de vidro previamente revestido com poli-lysina, um composto que ajudará as cutículas de vermes a grudar na superfície do vidro. Pressione suavemente outro deslizamento de vidro direto para baixo com uma borda sobrepondo o slide inferior. Para imobilizar os vermes sem danos, comprimir os animais evitando quaisquer movimentos laterais. Em seguida, coloque os slides de vidro com vermes sanduíches em um bloco de metal dentro de um recipiente de laboratório isolado cheio de um agente de congelamento, como nitrogênio líquido ou gelo seco.
O metal é um condutor de temperatura eficaz, garantindo que a superfície do bloco esteja fria o suficiente para congelar rapidamente as cutículas do verme em ambas as superfícies de vidro. Uma vez congelados, separe rapidamente as lâminas de vidro para separar ou quebrar as cutículas do verme. Proceda com fixação tecidual e coloração como interrupção da cutícula de baixa permeabilidade permite fixação química e anticorpos de coloração para acessar os tecidos interiores de vermes. No protocolo seguinte, veremos uma demonstração detalhada da técnica de congelamento e fixação tecidual.
Primeiro, prepare um slide para corrigir os vermes. Pipette 30 microliters de poli-L-lysine em um slide, umnd então, coloque um segundo slide sobre o outro e esfregue-os juntos para espalhar a solução uniformemente em ambos.
Em seguida, coloque um bloco de metal plano em um recipiente cheio de nitrogênio líquido. Lave as placas com solução M9 e transfira cerca de 10 microliters de M9 contendo os vermes. Alternativamente, escolha os vermes e adicione M9 ao slide.
Uma vez que os vermes são transferidos, solte suavemente um deslizamento de tampas cruzando-lhes de tal forma que o deslizamento de cobertura sobrepõe uma borda. Em seguida, pressione suavemente o deslizamento de tampas sem fazer nenhum movimento lateral.
Agora, transfira imediatamente o slide para o bloco metálico em nitrogênio líquido e deixe-o congelar. Após cinco minutos, tire a tampa usando a borda pendente.
Em seguida, mergulhe o slide em um frasco de Coplin de vidro recheado de metanol a menos 20 graus Celsius. Após cinco minutos, transfira o slide para um frasco de coplin de vidro cheio de acetona por mais cinco minutos na mesma temperatura.
