Encyclopedia of Experiments: Biology
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- Para uma análise pcr de um único verme, permita que um verme hermafrodita se auto fertilize e coloque ovos que produzirão descendentes geneticamente idênticos e, portanto, preservarão uma cópia da cepa modificada.
Congele o tubo a menos 80 graus Celsius para quebrar a cutícula ou camada externa. Aqueça a amostra para mais 60 graus Celsius para lise as células minhocas liberando as proteínas intracelulares junto com o DNA genômico da célula. Nesta temperatura, a proteína K dentro do buffer degrada as proteínas, particularmente nucleases que de outra forma destruiriam o DNA genômico.
Em seguida, eleve a temperatura para 95 graus Celsius para inativar a enzima. Por fim, adicione o lysato celular a um tubo com uma mistura mestre pcr composta de tampão de reação, dNTPs, primers para a frente e para trás para a região de interesse, polimerase taq e água trazendo a reação a um volume final desejado.
No exemplo a seguir, veremos um procedimento PCR para testar eventos de edição CRISPR-Cas9 no DNA genômico de worms F1 únicos.
- Após 1 a 2 dias de colocação de ovos, use uma foto de minhoca para transferir os F1s para tampas individuais de tubos de tira PCR contendo 7 microliters de tampão de lise quente. Centrifugar os tubos PCR em velocidade máxima e temperatura ambiente por um minuto para levar os animais para o fundo do tubo.
Em seguida, os vermes congelados de lise em um cicloviário térmico usando o programa a seguir. Em seguida, configure uma mistura mestre pcr como mostrado nesta tabela.
Adicione 21 microliters de mistura mestre PCR em tubos PCR limpos. Em seguida, adicione 4 microliters do tubo de lise minhoca e misture bem por pipetação.
Em seguida, execute o programa PCR seguindo as diretrizes do fabricante.
