Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- לניתוח PCR תולעת אחת, לאפשר תולעת הרמפרודיט להפרות עצמית להטיל ביצים שייצרו צאצאים זהים מבחינה גנטית ולכן, לשמר עותק של הזן שונה. לאחר מכן, להעביר את ההורה לצינור המכיל מאגר תמוגה תולעת.
להקפיא את הצינור במינוס 80 מעלות צלזיוס כדי לשבור לפתוח את הקוטיקל או את השכבה החיצונית.
לאחר מכן, להעלות את הטמפרטורה ל 95 מעלות צלזיוס כדי להשבית את האנזים. לבסוף, להוסיף את lysate התא לצינור עם תערובת PCR הורים המורכב חיץ תגובה, dNTPs, פריימרים קדימה והפוך עבור אזור עניין, taq polymerase, ומים להביא את התגובה לנפח הסופי הרצוי.
בדוגמה הבאה, נראה הליך PCR כדי להקרין עבור CRISPR-Cas9 אירועי עריכה ב- DNA הגנומי של תולעי F1 יחיד.
- לאחר 1 עד 2 ימים של הטלת ביצה, להשתמש בתמונת תולעת כדי להעביר את F1s לתוך כובעי צינור רצועת PCR בודדים המכילים 7 microliters של מאגר תמוגה חמה. צנטריפוגה צינורות PCR במהירות מקסימלית וטמפרטורת החדר במשך דקה אחת כדי להביא את בעלי החיים לתחתית הצינור.
לאחר מכן, lyse תולעים קפואות במחזור תרמי באמצעות התוכנית הבאה. לאחר מכן, הגדר שילוב ראשי של PCR כפי שמוצג בטבלה זו.
הוסף 21 מיקרוליטרים של PCR מאסטר לערבב לתוך צינורות PCR נקי. לאחר מכן, להוסיף 4 microliters של צינור תמוגה תולעת ומערבבים היטב על ידי pipetting.
לאחר מכן, הפעל את תוכנית PCR בהתאם להנחיות היצרן.
