Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- För PCR-analys med en mask, låt en hermafroditmask självbefrukta och lägga ägg som producerar genetiskt identiska avkommor och bevara därför en kopia av den modifierade stammen. Överför sedan föräldern till ett rör som innehåller masklysbuffert.
Frys röret vid minus 80 grader Celsius för att bryta upp nagelbandet eller det yttre skiktet. Värm provet till plus 60 grader Celsius för att lysa maskcellerna som frigör de intracellulära proteinerna tillsammans med cellens genomiska DNA.
Höj sedan temperaturen till 95 grader Celsius för att inaktivera enzymet. Slutligen tillsätt celllyatet till ett rör med en PCR-huvudblandning bestående av reaktionsbuffert, dNTPs, framåt och omvända primers för intresseområdet, taqpolymeras och vatten som ger reaktionen till önskad slutlig volym.
I följande exempel kommer vi att se en PCR-procedur för att screena för CRISPR-Cas9-redigeringshändelser i genomiskt DNA hos enstaka F1-maskar.
- Efter 1 till 2 dagars äggläggning, använd en maskbild för att överföra F1:orna till enskilda PCR-bandrörslock som innehåller 7 mikroliter varm lysbuffert.
Lys sedan frusna maskar i en termisk cyklator med följande program.
Tillsätt sedan 21 mikroliter PCR-masterblandning i rena PCR-rör. Tillsätt sedan 4 mikroliter av masklysröret och blanda väl genom pipetting.
Kör sedan PCR-programmet enligt tillverkarens riktlinjer.
