Encyclopedia of Experiments: Biology
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- Pour l’analyse pcr à vers unique, permettre à un ver hermaphrodite de se fertiliser et pondre des œufs qui produiront une progéniture génétiquement identique et, par conséquent, préserver une copie de la souche modifiée. Puis, transférer le parent à un tube contenant tampon de lyse de ver.
Congeler le tube à moins 80 degrés Celsius pour briser la cuticule ou la couche externe. Chauffer l’échantillon à plus de 60 degrés Celsius pour lyser les cellules vermifuges libérant les protéines intracellulaires avec l’ADN génomique de la cellule. À cette température, la protéine K dans le tampon dégrade les protéines, en particulier les nucléases qui détruiraient autrement l’ADN génomique.
Ensuite, augmenter la température à 95 degrés Celsius pour inactiver l’enzyme. Enfin, ajouter le lysate cellulaire à un tube avec un mélange principal pcr composé de tampon de réaction, dNT, amorces avant et arrière pour la région d’intérêt, taq polymése, et l’eau apportant la réaction à un volume final désiré. Pour effectuer le PCR, exécuter le programme de cycler thermique approprié qui amplifie la région de l’ADN d’intérêt.
Dans l’exemple suivant, nous verrons une procédure PCR pour dépister les événements d’édition CRISPR-Cas9 dans l’ADN génomique des vers F1 simples.
- Après 1 à 2 jours de ponte, utilisez une photo de ver pour transférer les F1 dans des bouchons individuels de tubes à bande PCR contenant 7 microlitres de tampon de lyse chaude. Centrifugez les tubes PCR à vitesse maximale et température ambiante pendant une minute pour amener les animaux au fond du tube. Ensuite, congelez les tubes à 80 degrés Celsius négatifs pendant une heure.
Ensuite, lyse vers congelés dans un cycleur thermique en utilisant le programme suivant. Puis, mettre en place un mélange maître PCR comme indiqué dans ce tableau.
Ajouter 21 microlitres de mélange principal PCR dans des tubes PCR propres. Puis, ajouter 4 microlitres du tube de lyse ver et bien mélanger par pipetting.
Ensuite, exécutez le programme PCR en suivant les directives du fabricant.
