Encyclopedia of Experiments: Biology
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- Per l'analisi PCR a verme singolo, consentire a un verme ermafrodita di autofertilizzare e deporre le uova che produrranno prole geneticamente identica e, pertanto, conservare una copia del ceppo modificato. Quindi, trasferire il genitore in un tubo contenente tampone di lisi del verme.
Congelare il tubo a meno 80 gradi Celsius per aprire la cuticola o lo strato esterno. Riscaldare il campione a più 60 gradi Celsius per liscindere le cellule del verme rilasciando le proteine intracellulari insieme al DNA genomico della cellula. A questa temperatura, la proteinasi K all'interno del tampone degrada le proteine, in particolare le nucleasi che altrimenti distruggerebbero il DNA genomico.
Quindi, aumentare la temperatura a 95 gradi Celsius per inattivare l'enzima. Infine, aggiungere il lisato cellulare a un tubo con un mix master PCR composto da tampone di reazione, dNTP, primer in avanti e indietro per la regione di interesse, taq polimerasi e acqua portando la reazione a un volume finale desiderato. Per eseguire la PCR, eseguire l'appropriato programma di ciclore termico che amplifica la regione di interesse del DNA.
Nell'esempio seguente, vedremo una procedura PCR da migliorare per gli eventi di editing CRISPR-Cas9 nel DNA genomico dei singoli worm F1.
- Dopo 1 o 2 giorni di deposizione delle uova, utilizzare una foto worm per trasferire gli F1 in singoli tappi per tubi a strisce PCR contenenti 7 microlitri di tampone di lisi calda. Centrifugare i tubi PCR alla massima velocità e temperatura ambiente per un minuto per portare gli animali sul fondo del tubo. Quindi congelare i tubi a -80 gradi Celsius per un'ora.
Successivamente, liscicolare i worm congelati in un ciclore termico utilizzando il programma seguente. Impostare quindi una combinazione master PCR, come illustrato in questa tabella.
Aggiungere 21 microlitri di miscela master PCR in tubi PCR puliti. Aggiungere quindi 4 microlitri del tubo di lisi del verme e mescolare bene mediante pipettazione.
Quindi, eseguire il programma PCR seguendo le linee guida del produttore.
