Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Encyclopedia of Experiments
Encyclopedia of Experiments: Biology

A subscription to JoVE is required to view this content.

 
Click here for the English version

Single Worm PCR: een methode om genomisch DNA te extraheren en te versterken

Article

Transcript

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

- Laat voor pcr-analyse met één worm een hermafrodietworm zelf bevruchten en eieren leggen die genetisch identieke nakomelingen produceren en daarom een kopie van de gemodificeerde stam behouden. Breng de ouder vervolgens over naar een buis met wormlysebuffer.

Vries de buis in bij min 80 graden Celsius om de cuticula of buitenste laag open te breken. Verwarm het monster tot plus 60 graden Celsius om de wormcellen te lyseren die de intracellulaire eiwitten vrijgeven, samen met het genomische DNA van de cel. Bij deze temperatuur degradeert het proteïnase K in de buffer de eiwitten, met name nucleases die anders het genomische DNA zouden vernietigen.

Verhoog vervolgens de temperatuur tot 95 graden Celsius om het enzym te inactiveren. Voeg ten slotte het cellysaat toe aan een buis met een PCR-mastermix bestaande uit reactiebuffer, dNTPs, voorwaartse en omgekeerde primers voor de regio van belang, taq polymerase en water die de reactie op een gewenst eindvolume brengen. Om de PCR uit te voeren, voert u het juiste thermische cycler-programma uit dat het DNA-gebied van belang versterkt.

In het volgende voorbeeld zien we een PCR-procedure om te screenen op CRISPR-Cas9-bewerkingsgebeurtenissen in het genomische DNA van enkele F1-wormen.

- Gebruik na 1 tot 2 dagen leggen een wormfoto om de F1's over te brengen in individuele PCR-stripbuisdoppen met 7 microliters warme lysisbuffer. Centrifugeer de PCR-buizen op maximale snelheid en kamertemperatuur gedurende één minuut om de dieren naar de bodem van de buis te brengen. Vries vervolgens de buizen gedurende een uur in op negatieve 80 graden Celsius.

Vervolgens lyse bevroren wormen in een thermische cycler met behulp van het volgende programma. Stel vervolgens een PCR-mastermix in zoals weergegeven in deze tabel.

Voeg 21 microliters PCR mastermix toe aan schone PCR-buizen. Voeg vervolgens 4 microliters van de wormlysebuis toe en meng goed door pipetten.

Voer vervolgens het PCR-programma uit volgens de richtlijnen van de fabrikant.

Tags

Lege waarde probleem
Read Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter