Один червь ПЦР: Метод для извлечения и усиления геномной ДНК

- Для анализа ПЦР одного червя, позвольте гермафродиту-червю самостоятельно оплодотворить и отложить яйца, которые будут производить генетически идентичное потомство и, следовательно, сохранить копию модифицированного штамма. Затем перенесите родителя в трубку, содержащую буфер лиза червя.

Заморозить трубку при температуре минус 80 градусов по Цельсию, чтобы разбить кутикулу или внешний слой. Нагрейте образец до плюс 60 градусов по Цельсию, чтобы вырезать клетки червя, высвобождающие внутриклеточные белки вместе с геномной ДНК клетки. При такой температуре белоказа K в буфере ухудшает белки, особенно нуклеазы, которые в противном случае разрушали бы геномную ДНК.

Затем поднимите температуру до 95 градусов по Цельсию, чтобы инактивировать фермент. Наконец, добавьте лизат клетки в трубку с мастер-миксом ПЦР, состоящим из буфера реакции, dNTPs, вперед и обратного грунтовки для области интереса, так полимеразы и воды, приносящих реакцию к желаемому конечному объему.

В следующем примере мы увидим процедуру ПЦР для проверки событий редактирования CRISPR-Cas9 в геномной ДНК одиночных червей F1.

- После 1 до 2 дней яйцекладки, используйте червь рис для передачи F1s в отдельных ПЦР полосы трубки шапки, содержащие 7 микролитров теплого буфера лиза. Центрифуга ПЦР трубки на максимальной скорости и комнатной температуры в течение одной минуты, чтобы довести животных до нижней части трубки. Затем заморозить трубки при отрицательном 80 градусов по Цельсию в течение одного часа.

Далее, лиза замороженных червей в тепловой циклер с помощью следующей программы.Затем, создать PCR мастер смеси, как показано в этой таблице.

Добавьте 21 микролитр смеси ПЦР мастер в чистые трубки ПЦР. Затем добавьте 4 микролитров трубки лиза червя и хорошо перемешайте с помощью пипетки.

Затем запустите программу PCR в соответствии с рекомендациями производителя.