Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Tek solucan PCR analizi için, bir hermafrodit solucanının genetik olarak aynı yavruları üretecek yumurtaları kendi kendine döllemesine ve bırakmasına izin verin ve bu nedenle değiştirilmiş suşun bir kopyasını koruyun.
Kütikül veya dış tabakayı açmak için tüpü eksi 80 santigrat derecede dondurun. Hücrenin genomik DNA'sı ile birlikte hücre içi proteinleri serbest bırakan solucan hücrelerini lyse etmek için numuneyi artı 60 santigrat dereceye ısıtın. Bu sıcaklıkta, tampon içindeki protein K proteinleri, özellikle genomik DNA'yı yok edecek çekirdekleri bozar.
Ardından, enzimi inaktive etmek için sıcaklığı 95 santigrat dereceye yükseltin. Son olarak, hücre lisatını reaksiyon tamponu, dNTP'ler, ilgi alanı için ileri ve ters astarlar, taq polimeraz ve reaksiyonu istenen son hacme getiren sudan oluşan bir PCR ana karışımı ile bir tüpe ekleyin. PCR'yi gerçekleştirmek için, ilginin DNA bölgesini yükselten uygun termal cycler programını çalıştırın.
Aşağıdaki örnekte, tek F1 solucanlarının genomik DNA'sında CRISPR-Cas9 düzenleme olaylarını taramak için bir PCR prosedürü göreceğiz.
- 1 ila 2 günlük yumurtlamadan sonra, F1'leri 7 mikrolitre sıcak lizis tamponu içeren bireysel PCR şerit tüp kapaklarına aktarmak için bir solucan resmi kullanın. Hayvanları tüpün dibine getirmek için PCR tüplerini maksimum hızda ve oda sıcaklığında bir dakika santrifüj edin.
Daha sonra, aşağıdaki programı kullanarak bir termal çevrimde donmuş solucanlar.
Temiz PCR tüplerine 21 mikrolitre PCR ana karışımı ekleyin.
Ardından, üreticinin yönergelerini izleyerek PCR programını çalıştırın.
