Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- For enkel orm PCR-analyse, la en hermafrodittorm selv gjødsle og legge egg som vil produsere genetisk identiske avkom og derfor bevare en kopi av den modifiserte stammen. Deretter overfører du foreldrene til et rør som inneholder orm lysisbuffer.
Frys røret ved minus 80 grader Celsius for å bryte opp kutikula eller det ytre laget. Varm opp prøven til pluss 60 grader Celsius for å lyse ormecellene som frigjør de intracellulære proteinene sammen med cellens genomiske DNA. Ved denne temperaturen forringer proteinase K i bufferen proteinene, spesielt nukleaser som ellers ville ødelegge det genomiske DNA.
Deretter øker du temperaturen til 95 grader Celsius for å inaktivere enzymet. Til slutt legger du til cellelyset til et rør med en PCR-mesterblanding sammensatt av reaksjonsbuffer, dNTPer, fremover og omvendt primere for interesseområdet, taq polymerase og vann som bringer reaksjonen til et ønsket sluttvolum. For å utføre PCR, kjør riktig termisk cycler-program som forsterker DNA-regionen av interesse.
I eksemplet nedenfor vil vi se en PCR-prosedyre for å screene for CRISPR-Cas9-redigeringshendelser i det genomiske DNA-et til enkle F1-ormer.
- Etter 1 til 2 dager med egglegging, bruk et ormbilde for å overføre F1-ene til individuelle PCR-striperørhetter som inneholder 7 mikroliter varm lysisbuffer. Sentrifuger PCR-rørene med maksimal hastighet og romtemperatur i ett minutt for å bringe dyrene til bunnen av røret. Deretter fryser du rørene ved negative 80 grader Celsius i en time.
Deretter lyser frosne ormer i en termisk syklist ved hjelp av følgende program. Sett deretter opp en PCR-hovedblanding som vist i denne tabellen.
Tilsett deretter 21 mikroliter PCR master mix i rene PCR-rør. Tilsett deretter 4 mikroliter av ormelysrøret og bland godt ved pipettering.
Kjør deretter PCR-programmet i henhold til produsentens retningslinjer.
