Nile Red Staining of C. elegans: Eine Methode zur Visualisierung von Lipidtröpfchen bei festen Tieren

- Bei der Visualisierung von Lipidtröpfchen beginnen die intrazellulären Speicherorganellen für neutrale Lipide mit einer Waschmittellösung, wie z. B. einer, die Triton X-100 enthält, zur Probe. Dies wird die Zellen des Wurms durchdringen. Als nächstes fixieren Sie die Probe in der entsprechenden Konzentration von Isopropanol, z. B. 40%.

Dann fügen Sie Nile Red der Probe hinzu und schützen Sie sie vor Licht, da der Farbstoff lichtempfindlich ist. Fixierung ermöglicht es dem Farbstoff, lipidtröpfchen im gesamten Tier zu gelangen. Nile Red ist ein lipophiler Farbstoff, dessen Fluoreszenzemissionsspektrum von der Polarität der lokalen Lipidumgebung abhängt.

Bei expositionsgefährdeten polaren Lipiden wie Phospholipiden liegt das Emissionsspektrum von Nile Red in den höheren, roten Wellenlängen. Wenn es neutralen Lipiden wie Triacylglycerolen und Sterolestern im neutralen Kern von Lipidtröpfchen ausgesetzt ist, verschiebt sich das Emissionsspektrum von Nile Red in die unteren, gelbgoldenen Wellenlängen.

Verwenden Sie daher den grünen Kanal eines Fluoreszenzmikroskops, das die Gelb-Gold-Wellenlängenemissionen sammelt, um die Nilrotfärbung von Lipidtröpfchen im gesamten Tier zu visualisieren. Im Beispielprotokoll werden wir ein Nile Red Färbeverfahren und die Abbildung von Lipidtröpfchen in festen Proben sehen.

- Zur Durchführung von Nile Red Lipid färbung, Plattenwürmer auf Nematoden-Wachstumsmedium, oder NGM, mit spätem Log OP50 E. coli gesät, und wachsen die Würmer bei 20 Grad Celsius bis frühe L4-Stufe. Waschen Sie die Würmer mit 1 Milliliter PBST-Lösung und übertragen Sie die Wurmsuspension auf eine 1,5 Milliliter Mikrofuge Tube.

Zentrifugieren Sie die Würmer mit 560-facher Schwerkraft für eine Minute, entfernen Sie dann den Überstand und wiederholen Sie die PBST-Wäsche, bis die E. coli von der Suspension befreit ist. Als nächstes, zum Wurmpellet, fügen Sie 100 Mikroliter von 40% Isopropanol, oder 60% für ORO Färbung, und inkubieren die Probe bei Raumtemperatur für drei Minuten.

- Die Zugabe von Isopropanol ist entscheidend für die richtige Permeabilisierung der Würmer vor der Färbung.

- Zentrifugieren Sie die Würmer mit 560-facher Schwerkraft für eine Minute und entfernen Sie den Überstand, ohne das Wurmpellet zu stören.

- Es ist wichtig, die Lichteinwirkung während der Zentrifugationsschritte zu minimieren.

- Jetzt, während im Dunkeln, fügen Sie 600 Mikroliter der zuvor vorbereiteten NR Arbeitslösung zu jeder Probe. Invertieren Sie die Rohre dreimal und vollständig mischen Sie die Würmer und Lösung. Dann inkubieren Sie die Probe im Dunkeln bei Raumtemperatur für zwei Stunden.

Zentrifugieren Sie nach der Inkubation die Würmer und entfernen Sie den Überstand. Dann 600 Mikroliter PBST hinzufügen und die Proben im Dunkeln für 30 Minuten bebrüten, um den überschüssigen NR-Fleck zu entfernen. Nach dem erneuten Drehen der Proben wie zuvor, entfernen Sie alle bis auf etwa 50 Mikroliter Überstand.