Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- בעת הדמיה טיפות השומנים, אברוני אחסון תאיים עבור שומנים ניטרליים, להתחיל על ידי הוספת פתרון דטרגנט, כגון אחד המכיל טריטון X-100, לדגימה.
לאחר מכן, להוסיף אדום הנילוס למדגם ולהגן עליו מפני אור, שכן הצבע הוא רגיש לאור. קיבוע מאפשר לצבוע לגשת טיפות השומנים ברחבי החיה. הנילוס האדום הוא צבע ליפופילי ספקטרום פליטת הפלואורסצנטיות שלו תלוי בקוטביות של סביבת השומנים המקומית.
כאשר נחשפים שומנים קוטביים, כגון פוספוליפידים, ספקטרום הפליטה של הנילוס האדום הוא גבוה יותר, אורכי גל אדומים.
לכן, השתמש בערוץ הירוק של מיקרוסקופ פלואורסצנטי, אשר יאסוף את פליטת אורך הגל צהוב-זהב, כדי לדמיין כתמים אדומים הנילוס של טיפות השומנים ברחבי החיה. בפרוטוקול לדוגמה, נראה הליך כתמים אדום הנילוס והדמיה של טיפות שומנים בדגימות קבועות.
- כדי לבצע כתמי שומנים אדומים הנילוס, תולעי צלחת על מדיום צמיחה nematode, או NGM, זרע עם יומן מאוחר OP50 E. coli, ולגדל את התולעים ב 20 מעלות צלזיוס לשלב L4 מוקדם. לשטוף את התולעים עם 1 מיליליטר של פתרון PBST ולהעביר את התולעת התולעת צינור מיקרו דלק 1.5 מיליליטר.
צנטריפוגה התולעים ב 560 פעמים כוח המשיכה במשך דקה אחת, ולאחר מכן להסיר את supernatant ולחזור על לשטוף PBST עד E. coli מנוקה מן ההשעיה. הבא, גלולת התולעת, להוסיף 100 microliters של 40% isopropanol, או 60% עבור כתמי ORO, ולהדגיר את המדגם בטמפרטורת החדר במשך שלוש דקות.
- התוספת של isopropanol הוא חיוני עבור חדירה נאותה של התולעים לפני הכתמת.
- צנטריפוגה התולעים ב 560 פעמים כוח המשיכה לדקה אחת ולהסיר את supernatant מבלי לשבש את גלולת התולעת.
- חשוב למזער את החשיפה לאור במהלך שלבי הצנטריפוגה.
- עכשיו, בעוד בחושך, להוסיף 600 microliters של פתרון עבודה NR שהוכן בעבר לכל מדגם.
לאחר הדגירה, צנטריפוגה את התולעים ולהסיר את supernatant. ואז להוסיף 600 microliters של PBST ולהדגיר את הדגימות בחושך במשך 30 דקות כדי להסיר את הכתם NR עודף. לאחר סיבוב הדגימות שוב כמו קודם, להסיר את כל אבל כ 50 microliters של supernatant.
