Encyclopedia of Experiments: Biology
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- Ao visualizar gotículas lipídicas, as organelas de armazenamento intracelulares para lipídios neutros, começam adicionando uma solução de detergente, como uma contendo Triton X-100, à amostra. Isso permeabiliizará as células do verme. Em seguida, fixará a amostra na concentração apropriada de isopropanol, por exemplo, 40%.
Em seguida, adicione Nilo Vermelho à amostra e proteja-a da luz, já que o corante é sensível à luz. A fixação permite que o corante acesse gotículas lipídicas em todo o animal. Nilo Vermelho é um corante lipofílico cujo espectro de emissão de fluorescência depende da polaridade do ambiente lipídico local.
Quando exposto a lipídios polares, como fosfolipídios, o espectro de emissões do Nilo Vermelho está nos comprimentos de onda vermelhos mais altos. Quando exposto a lipídios neutros, como triaciglicerols e ésteres de esterol no núcleo neutro de gotículas lipídicas, o espectro de emissões do Nilo Red muda para os comprimentos de onda de ouro amarelo mais baixos.
Portanto, use o canal verde de um microscópio fluorescente, que coletará as emissões de comprimento de onda amarelo-ouro, para visualizar a coloração do Nilo Vermelho de gotículas lipídicas em todo o animal.
- Para realizar a coloração lipídica vermelha do Nilo, os vermes de placa no meio de crescimento de nematoide, ou NGM, semeados com o tronco tardio OP50 E. coli, e cultivar os vermes a 20 graus Celsius até o estágio L4 inicial. Lave os vermes com 1 mililitro de solução PBST e transfira a suspensão do verme para um tubo de microfuge de 1,5 mililitro.
Centrifugar os vermes a 560 vezes a gravidade por um minuto, depois remova o supernascer e repita a lavagem PBST até que o E. coli seja liberado da suspensão. Em seguida, à pelota de verme, adicione 100 microlitradores de 40% de isopropanol, ou 60% para a coloração oro, e incubar a amostra à temperatura ambiente por três minutos.
- A adição de isopropanol é crucial para a permeabilização adequada dos vermes antes da coloração.
- Centrifugar os vermes a 560 vezes a gravidade por um minuto e remover o supernante sem interromper a pelota de verme.
- É importante minimizar a exposição à luz durante as etapas de centrifugação.
- Agora, enquanto no escuro, adicione 600 microliters de solução de trabalho nr previamente preparada para cada amostra. Inverta os tubos três vezes e misture totalmente os vermes e a solução.
Após a incubação, centrifufique os vermes e remova o supernascer. Em seguida, adicione 600 microliters de PBST e incuba as amostras no escuro por 30 minutos para remover o excesso de mancha NR. Depois de girar as amostras novamente como antes, remova todos, exceto aproximadamente 50 microlitres de supernante.
