Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- ابدأ بالديدان المغسولة واضف حاجز التحلل الذي يحتوي على SDS والمنظفات وDDT، وهو عامل تقليل.
بعد ذلك، قم بإزالة كواشف التحلل مع العديد من الغسالات من عازل العزل البارد.
إضافة وسائل الإعلام التي تحتوي على المصل لوقف تفاعل الانزيم والمضادات الحيوية لمنع التلوث. بيليه وغسل العينة عدة مرات لإزالة معظم الحطام.
وأخيرا، ضع الأنبوب على الجليد للسماح بترسب الجاذبية.
في بروتوكول المثال ، سنقوم بفك الديدان المعدلة وراثيا التي تعبر عن GFP في الخلايا العصبية ذات الاهتمام لعزل وتحليل تلك الخلايا.
- بعد جمع الحيوانات، قم بالطرد المركزي منها بمعدل 1600 مرة جرام لمدة خمس دقائق.
الطرد المركزي في 1600 مرة ز لمدة خمس دقائق بيليه الديدان.
بعد ذلك ، أضف 800 ميكرولتر من عازل العزل البارد الجليدي واخلطه عن طريق النقر برفق على الأنبوب.
كرر عملية الطرد المركزي والغسيل هذه ما مجموعه خمس مرات ، مع التأكد من إزالة حاجز العزل بعناية في كل مرة.
احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 إلى 15 دقيقة. التأكد من تطبيق اضطراب ميكانيكي عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا 60 إلى 70 مرة مع طرف micropipette 200 ميكرولتر ضد الجزء السفلي من الأنبوب.
بعد خمس إلى سبع دقائق، يجب أن تحتوي شظايا الدودة على كتل منخفض بشكل واضح وسيكون ملاط من الخلايا مرئيا بسهولة.
الطرد المركزي في 10،000 مرة ز وعلى 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق لبيليه شظايا معزولة والخلايا. غسل الخلايا بيليه مرتين أكثر مع وسائل الإعلام الباردة L15 تكمل باستخدام 1 ملليلتر من وسائل الإعلام لكل غسل. إعادة تعليق الخلايا بيليه في 1 ملليلتر من وسائل الإعلام L15 تكمل وترك على الجليد لمدة 30 دقيقة.
ثم، خذ الطبقة العليا، التي هي حوالي 700 إلى 800 ميكرولتر، ونقلها إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق.
