Single Cell Dissociation of Caenorhabditis elegans: Een methode om levende cellen te isoleren

- Begin met gewassen pelletwormen en voeg een lysisbuffer toe met SDS, een wasmiddel en DDT, een reductiemiddel. Dit breekt de beschermende cuticula van de worm af die het lichaam blootstelt aan celdissociatie. Vermijd langdurige blootstelling aan de lysisbuffer om cellyse en de dood te minimaliseren.

Verwijder vervolgens de lysisreagentia met verschillende wasbeurten koude isolatiebuffer. Het is belangrijk dat deze buffer van de juiste osmolariteit is om celdood te voorkomen. Gebruik een protease-enzym om cel-naar-celverbindingen af te breken. Help het homogenisatieproces samen met mechanische energie door het mengsel tegen de buiswand te leiden.

Voeg media toe die serum bevatten om de enzymreactie te stoppen en antibiotica om besmetting te voorkomen. Pellet en was het monster meerdere keren om het grootste deel van het vuil te verwijderen.

Plaats ten slotte de buis op ijs om zwaartekrachtsedimentatie mogelijk te maken. Vuil, inclusief resten van de cuticula of celklonters, zal zich nestelen, terwijl gedissocieerde cellen in de bovenste laag van de media blijven hangen. Deze cellen kunnen worden gebruikt voor het cultiveren op korte termijn of om specifieke celpopulaties te isoleren door FACS of immunoprecipitatie.

In het voorbeeldprotocol zullen we transgene wormen loskoppelen die GFP uitdrukken in neuronen die van belang zijn om die cellen te isoleren en te analyseren.

- Na het verzamelen van de dieren, centrifugeer ze op 1.600 keer g gedurende vijf minuten. Verwijder al het supernatant en hang de wormen opnieuw op in 1 milliliter M9-media. Breng de suspensie over op een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter.

Centrifugeer gedurende vijf minuten op 1600 keer g om de wormen te pelleteren. Voeg vervolgens 200 microliters SDS-DDT-buffer toe en incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. De wormen moeten nu langs het lichaam lijken te zijn gerimpeld als ze onder een lichtmicroscoop worden bekeken.

Voeg vervolgens 800 microliter ijskoude isolatiebuffer toe en meng door zachtjes op de buis te draaien. Centrifugeer op 13.000 keer g en op 4 graden Celsius gedurende een minuut om de wormen te pelleteren. Verwijder het supernatant en was met 1 milliliter isolatiebuffer.

Herhaal dit centrifugeer- en wasproces in totaal vijf keer en zorg ervoor dat u de isolatiebuffer elke keer zorgvuldig verwijdert. Voeg hierna 100 microliters proteasemengsel van Streptomyces griseus opgelost in isolatiebuffer toe aan de pellet.

Incubeer gedurende 10 tot 15 minuten bij kamertemperatuur. Zorg ervoor dat u mechanische verstoring toepast door 60 tot 70 keer op en neer te pipetten met de 200 microliter micropipetpunt tegen de bodem van de buis. Om het stadium van de spijsvertering te bepalen, verwijdert u 1 tot 5 microliters van het spijsverteringsmengsel, laat u het op een glazen dia vallen en inspecteert u het met een weefselkweekmicroscoop.

Na vijf tot zeven minuten moeten wormfragmenten een zichtbaar verminderde cuticula hebben en zal een slurry van cellen gemakkelijk zichtbaar zijn. Stop de reactie door 900 microliters in de handel verkrijgbaar Leibovitz's L15-medium toe te voegen, aangevuld met 10% FBS en penicilline-streptomycine.

Centrifugeer op 10.000 maal g en bij 4 graden Celsius gedurende 5 minuten om geïsoleerde fragmenten en cellen te pelleteren. Was de pelletcellen nog twee keer met koude L15 aangevulde media met 1 milliliter media per wasbeurt. Hang de pelletcellen opnieuw op in 1 milliliter L15 aangevulde media en laat 30 minuten op ijs staan.

Neem vervolgens de bovenste laag, die ongeveer 700 tot 800 microliter is, en breng deze over naar een microcentrifugebuis. Gebruik een geautomatiseerde celteller of hemocytometer om de celdichtheid van 10 tot 25 microliters geïsoleerde cellen te meten.