Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Begynn med vaskede pelleterte ormer og tilsett lysisbuffer som inneholder SDS, et vaskemiddel og DDT, et reduksjonsmiddel. Dette bryter ned ormens beskyttende kutiklet og utsetter kroppen for celledissosiasjon. Unngå langvarig eksponering for lysisbufferen for å minimere cellelys og død.
Deretter fjerner du lysisreagensene med flere vasker av kald isolasjonsbuffer. Det er viktig at denne bufferen har riktig osmolaritet for å forhindre celledød. Bruk et proteaseenzym for å bryte ned celle til celleforbindelser. Hjelp homogeniseringsprosessen sammen med mekanisk energi ved å pipettere blandingen mot rørveggen.
Tilsett medier som inneholder serum for å stoppe enzymreaksjonen og antibiotika for å forhindre forurensning. Pellet og vask prøven flere ganger for å fjerne det meste av ruskene.
Til slutt, plasser røret på isen for å tillate tyngdekraftssedimentering. Rusk inkludert rester av kutiklet eller celleklumpene vil slå seg ned, mens dissosierte celler forblir suspendert i det øverste medielaget. Disse cellene kan brukes til kortsiktig culturing eller for å isolere spesifikke cellepopulasjoner ved FACS eller immunoprecipitation.
I eksempelprotokollen vil vi dissosiere transgene ormer som uttrykker GFP i nevroner av interesse for å isolere og analysere disse cellene.
- Etter å ha samlet dyrene, sentrifuger dem på 1600 ganger g i fem minutter. Fjern alle supernatanten og re-suspender ormene i 1 milliliter M9 media. Overfør suspensjonen til et 1,5 milliliter mikrosenterrifugerør.
Sentrifuge på 1600 ganger g i fem minutter for å pellet ormene. Deretter legger du til 200 mikroliter SDS-DDT buffer og inkuberer ved romtemperatur i fem minutter. Ormene skal nå se ut til å være rynkete langs kroppen hvis de ses under et lysmikroskop.
Deretter tilsetter du 800 mikroliter iskald isolasjonsbuffer og blander ved å flikke forsiktig på røret. Sentrifuge ved 13.000 ganger g og ved 4 grader Celsius i ett minutt for å pellet ormene. Fjern supernatanten og vask med 1 milliliter isolasjonsbuffer.
Gjenta denne sentrifugerings- og vaskeprosessen totalt fem ganger, sørg for å forsiktig fjerne isolasjonsbufferen hver gang. Etter dette legger du til 100 mikroliter proteaseblanding fra Streptomyces griseus oppløst i isolasjonsbuffer, til pellets.
Inkuber ved romtemperatur i 10 til 15 minutter. Sørg for å påføre mekanisk forstyrrelse ved å pipettere opp og ned 60 til 70 ganger med mikropipettespissen på 200 mikroliter mot bunnen av røret. For å bestemme fordøyelsesstadiet, fjern 1 til 5 mikroliter av fordøyelsesblandingen, slipp den på en glasssklie og inspiser den ved hjelp av et vevskulturmikroskop.
Etter fem til syv minutter skal ormefragmenter ha en synlig redusert kutikal og en slurry av celler vil være lett synlig. Stopp reaksjonen ved å legge til 900 mikroliter kommersielt tilgjengelige Leibovitz's L15 medium supplert med 10% FBS og penicillin-streptomycin.
Sentrifuge ved 10.000 ganger g og ved 4 grader Celsius i 5 minutter til pellet isolerte fragmenter og celler. Vask de pelleterte cellene to ganger til med kalde L15-supplerte medier ved hjelp av 1 milliliter medier per vask.
Ta deretter det øverste laget, som er omtrent 700 til 800 mikroliter, og overfør det til et mikrocentrifugerør. Bruk en automatisert celleteller eller hemocytometer for å måle celletettheten på 10 til 25 mikroliter isolerte celler.
