Одноклеточная диссоциация caenorhabditis elegans: Метод изоляции живых клеток

- Начните с промытых гранулами червей и добавьте буфер лиза, содержащий SDS, моющее средство и ДДТ, уменьшающий агент. Это разрушает защитную кутикулу червя, подвергающую тело клеточной диссоциации. Избегайте длительного воздействия буфера лиза, чтобы свести к минимуму лиз клеток и смерть.

Далее удалите реагенты лиза с несколькими моет холодного буфера изоляции. Важно, что этот буфер имеет правильную осмоляность, чтобы предотвратить гибель клеток. Используйте фермент протеазы, чтобы расщепление клетки к соединениям клеток. Помощь процесса гомогенизации вместе с механической энергией путем трубопроводов смесь против стенки трубки.

Добавить средства массовой информации, содержащие сыворотку, чтобы остановить ферментную реакцию и антибиотики, чтобы предотвратить загрязнение. Pellet и мыть образец несколько раз, чтобы удалить большую часть мусора.

Наконец, поместите трубку на лед, чтобы обеспечить гравитационную осадообразование. Обломки, включая остатки кутикулы или клеточных комков, оседают, в то время как диссоциированные клетки остаются подвешенными в верхнем слое сми. Эти клетки могут быть использованы для краткосрочного культивирования или изоляции конкретных популяций клеток с помощью FACS или иммунопреципиентации.

В примере протокола, мы будем разобщать трансгенных червей, выражаюющих GFP в нейронах, представляющих интерес для изоляции и анализа этих клеток.

- После сбора животных, центрифуга их в 1600 раз г в течение пяти минут. Удалить все супернатанты и повторно приостановить червей в 1 миллилитр M9 media. Передача подвески в 1,5-миллилитровый микроцентрифуг трубки.

Центрифуга в 1600 раз г в течение пяти минут, чтобы гранулировать червей. Затем добавьте 200 микролитров буфера SDS-DDT и инкубировать при комнатной температуре в течение пяти минут.

Далее добавьте 800 микролитров ледяного буфера изоляции и смешайте, аккуратно щелкнуть трубку. Центрифуга при 13 000 раз г и при 4 градусах по Цельсию в течение одной минуты гранулировать червей. Удалите супернатант и вымойте 1 миллилитр изоляционные буфера.

Повторите этот процесс центрифугации и мытья в общей сложности пять раз, убедившись, что тщательно удалить буфер изоляции каждый раз. После этого, добавить 100 микролитров смеси протеазы из Streptomyces griseus растворяется в буфере изоляции, к грануле.

Инкубация при комнатной температуре от 10 до 15 минут. Убедившись, что применять механические нарушения путем трубопроводов вверх и вниз от 60 до 70 раз с 200 микролитера микропипета кончиком против нижней части трубки.

Через пять-семь минут фрагменты червя должны иметь заметно уменьшенную кутикулу и суспензию клеток.

Центрифуга при 10 000 раз г и при 4 градусах по Цельсию в течение 5 минут гранулировать изолированные фрагменты и клетки. Вымойте гранулированные клетки в два раза больше с помощью холодных L15 дополненных средств массовой информации с использованием 1 миллилитров средств массовой информации на стирку. Повторно приостановить гранулированные клетки в 1 миллилитр L15 дополненных средств массовой информации и оставить на льду в течение 30 минут.

Затем возьмите верхний слой, который составляет примерно от 700 до 800 микролитров, и перенесите его в микроцентрифугную трубку. Используйте автоматизированный счетчик клеток или гемоцитометр для измерения плотности клеток от 10 до 25 микролитров изолированных клеток.