Caenorhabditis elegans'ınTek Hücreli Ayrışması : Canlı Hücreleri İzole Etme Yöntemi

- Yıkanmış peletlenmiş solucanlarla başlayın ve SDS, deterjan ve bir azaltıcı madde olan DDT içeren lizis tamponu ekleyin. Bu, hücre ayrışması için vücudu açığa çıkaran solucanın koruyucu kütiküllerini parçalar. Hücre lizizini ve ölümü en aza indirmek için liziz tampona uzun süre maruz kalmaktan kaçının.

Daha sonra, birkaç soğuk izolasyon tamponu yıkaması ile lizis reaktiflerini çıkarın. Hücre ölümünü önlemek için bu tamponun doğru ozmolaritede olması önemlidir. Hücreden hücre bağlantılarına parçalamak için bir proteaz enzimi kullanın. Karışımı tüp duvarına borulayarak mekanik enerji ile birlikte homojenizasyon işlemine yardımcı olun.

Kontaminasyonu önlemek için enzim reaksiyonu ve antibiyotikleri durdurmak için serum içeren ortam ekleyin.

Son olarak, yerçekimi çökeltisine izin vermek için tüpü buza yerleştirin. Kütikül veya hücre kümelerinin kalıntıları da dahil olmak üzere döküntüler yerleşir, ayrışmış hücreler ise ortamın üst katmanında asılı kalır. Bu hücreler kısa süreli kültleme veya facs veya immün önseçim tarafından belirli hücre popülasyonlarını izole etmek için kullanılabilir.

Örnek protokolde, bu hücreleri izole etmek ve analiz etmek için ilgi çekici nöronlarda GFP'yi ifade eden transgenik solucanları ayrıştıracağız.

- Hayvanları topladıktan sonra, beş dakika boyunca 1.600 kez g'da santrifüjleyin. Tüm süpernatantı çıkarın ve solucanları 1 mililitre M9 medyasında yeniden askıya alın. Süspansiyonu 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.

Solucanları peletmek için beş dakika boyunca 1.600 kez g santrifüj.

Daha sonra, 800 mikrolitre buz-soğuk izolasyon tamponu ekleyin ve tüpü hafifçe sallayarak karıştırın. Solucanları peletmek için 13.000 kez g ve 4 santigrat derecede santrifüj.

Bu santrifüjleme işlemini tekrarlayın ve her seferinde izolasyon tamponunu dikkatlice çıkardığınızdan emin olarak toplam beş kez yıkayın. Bundan sonra, izolasyon tamponunda çözünmüş Streptomyces griseus'tan pelete 100 mikrolitre proteaz karışımı ekleyin.

Oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika kuluçkaya yaslanın. Tüpün altına doğru 200 mikrolitre mikropiplet ucu ile 60 ila 70 kez yukarı ve aşağı pipetleme yaparak mekanik bozulma uyguladığınızdan emin olun. Sindirim aşamasını belirlemek için sindirim karışımının 1 ila 5 mikrolitresini çıkarın, cam bir kaydırağa bırakın ve bir doku kültürü mikroskobu kullanarak inceleyin.

Beş ila yedi dakika sonra, solucan parçaları gözle görülür şekilde azaltılmış bir kütiküle sahip olmalı ve bir hücre bulamacı kolayca görülebilecektir. % 10 FBS ve penisilin-streptomisin ile desteklenmiş 900 mikrolitre ticari olarak mevcut Leibovitz'in L15 ortamını ekleyerek reaksiyonu durdurun.

Santrifüj 10.000 kez g ve 4 santigrat derecede 5 dakika boyunca izole edilmiş parçaları ve hücreleri peletleme. Peletlenmiş hücreleri, yıkama başına 1 mililitre ortam kullanarak soğuk L15 takviyeli ortamla iki kez daha yıkayın.

Daha sonra, yaklaşık 700 ila 800 mikrolitre olan üst katmanı alın ve bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.