エタノール固定とDAPI染色:C.エレガンスにおけるDNAを可視化する方法

- 顕微鏡スライド上の緩衝液の滴から始めて、無傷のワームを液滴に移す。ワームが所定の位置に入ったら、糸くずのない組織を使って緩衝液を浸して取り除き、サンプルを90%エタノールで数回浸してサンプルを固定し、各塗布後に蒸発させる。

エタノールが最終リンスの後に蒸発したら、核酸染料を含む溶液を添加し、DAPIはDNAのマイナーな溝の中でアデニンおよびチミン塩基に優先的に結合する。

次に、アンチフェード保存剤を加えてサンプルの保存期間を延長します。 カバースリップを適用し、スライドにそれをシールします。その後、青色のフィルターを備えた蛍光顕微鏡を使用して、細胞とそのサイクル状態に応じて、単一の染色体、姉妹染色体ペア、または核全体を表すことができるDAPIボディを視覚化します。

- テトラボイド株は12個の染色体を持ち、受精していない卵母細胞にDAPI染色体を数えることで検証できる。そのためには、M9バッファの5〜10マイクロリットルをスライドに落とし、6〜10個の推定四トラボイドをドロップに移す。

その後、10マイクロリットルの90%エタノールをワームに落としてエタノールが完全に蒸発するのを見守る。蒸発が終わったらすぐにエタノールを加えて蒸発するのを見守る。

スライドの長期保存のために、市販のワームまたは自家製のアンチフェードにワームを取り付けます。その後、カバースリップを追加し、マニキュアでエッジを密封します。

まず、最も成熟した未受精卵母細胞を見つけ、 精子に隣接し、まだ精子や子宮のいずれにも入っていない。ここでのDAPI体はおそらく単染色体ペアである。次に、卵母細胞の核に焦点を当て、顕微鏡の細かい焦点を使って上から下までゆっくりとスキャンし、DAPI体を数えながら、同じ核内のDAPI体を数える。

野生型卵母細胞は平均6体のDAPIボディを持つ。12体のDAPIボディの存在は、この株の動物が部分的または完全な四量体であることを示している。