Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Begynn med en dråpe bufferløsning på et mikroskop og overfør intakte ormer til dråpen. Når ormene er på plass, bruk et lofritt vev for å suge opp og fjerne bufferen. Fest prøven ved å bade prøvene med 90% etanol flere ganger, slik at den kan fordampe etter hver applikasjon.
Når etanol har fordampet etter den endelige skyllingen, legg til en løsning som inneholder nukleinsyrefargen, DAPI, til prøven. DAPI binder seg fortrinnsvis til adenin- og tyminbaser i det mindre sporet av DNA. Når det er bundet, absorberer DAPI-DNA-komplekset UV-lys og avgir synlig blått lys.
Legg deretter til et konserveringsmiddel mot falming for å forlenge holdbarheten til prøven. Bruk deretter et fluorescerende mikroskop med et blått filter for å visualisere DAPI-kropper, som, avhengig av cellen og dens syklusstatus, kan representere enkle kromosomer, søsterkromotidpar eller hele kjerner. I dette eksperimentet vil vi telle DAPI-farget søsterkromotidpar i oocytter, for å identifisere tetraploide stammer av Caenorhabditis elegans.
- Tetraploide stammer har 12 kromosompar, som kan valideres ved å telle DAPI-fargede kropper i unfertilized oocytter. For å gjøre det, slipp fem til ti mikroliter M9-buffer på et lysbilde og overfør seks til 10 putative tetraploider i dråpen. Under et dissekerende mikroskop, suge forsiktig opp det meste av M9 til et lofritt rengjøringsvev.
Slipp deretter 10 mikroliter på 90% etanol på ormene og se etanol fordampe helt. Så snart fordampning er ferdig, gjenta prosessen med å legge til etanol og se det fordampe. Totalt legger du til 10 mikroliter i fire applikasjoner. Etter at siste dråpe fordamper, legg til seks mikroliter DAPI ved to nanogram per mikroliter, eller en lignende flekk.
For langvarig lagring av lysbildene, monter ormene i en kommersielt tilgjengelig eller hjemmelaget anti-fade. Legg deretter til en dekslelip og forsegle kantene med neglelakk. Etter at neglelakken har tørket, kan lysbildene scores. Bruk et fluorescerende mikroskop og 100 x forstørrelse.
Først finner du den mest modne unfertilized oocyte, som er rett ved siden av spermatheca, og har ennå ikke kommet inn i verken spermatheca eller livmor. DAPI-kroppene her er antagelig enkle kromosompar. Deretter fokuserer du på kjernen av oocytten og bruker mikroskopets fine fokus til sakte å skanne det, fra topp til bunn, mens du teller DAPI-kroppene.
Wild type oocytter har seks DAPI-kropper i gjennomsnitt. Tilstedeværelsen av 12 DAPI-kropper indikerer at dyrene i denne stammen enten er delvise eller komplette tetraploider. Analyser minst 10 dyr per stamme. Ofte vil kromosompar være svært nær eller berøre, slik at antall DAPI-kropper ofte er mindre enn det faktiske antall kromosompar.
