Фиксация этанола и daPI окрашивание: метод визуализации ДНК в C. elegans

- Начните с капли буферного раствора на слайде микроскопа и перенесите нетронутых червей на каплю. Как только черви находятся на месте, используйте ткань без ворса, чтобы впитать и удалить буфер. Fix образец, купая образцы с 90% этанола несколько раз, что позволяет ему испаряться после каждого применения.

После того, как этанол испарится после окончательного полоскания, добавьте раствор, содержащий нуклеиновый кислотный краситель, DAPI, в образец. DAPI связывается преимущественно с адениновыми и тиминовыми основаниями в незначительной канавке ДНК. При привязке комплекс DAPI-DNA поглощает ультрафиолетовый свет и излучает видимый синий свет.

Затем добавьте анти-увядание консерванта, чтобы продлить срок годности образца. Применить крышку скольжения и запечатать его на слайде. Затем используйте флуоресцентный микроскоп с синим фильтром, чтобы визуализировать тела DAPI, которые, в зависимости от клетки и ее состояния цикла, может представлять собой одиночные хромосомы, сестра хроматидных пар, или целые ядра. В этом эксперименте, мы будем считать DAPI окрашенных пар сестра хроматид в яйцеклетки, для выявления тетраплоидных штаммов Каенхабит.

- Тетраплоидные штаммы имеют 12 хромосомных пар, которые могут быть проверены путем подсчета окрашенных тел DAPI в неопыленных ооцитах. Для этого уроните от пяти до десяти микролитров буфера M9 на слайд и перенесите от шести до 10 гетраплоидов в каплю. Под рассеченным микроскопом тщательно впитывайте большую часть M9 в льняную чистящую ткань.

Затем падение 10 микролитров 90% этанола на червей и смотреть этанол испаряются полностью. Как только испарение заканчивается, повторить процесс добавления этанола и смотреть его испарения. В общей сложности, добавить 10 микролитров в четырех приложениях. После последней капли испаряется, добавить шесть микролитров DAPI на два нанограмма на микролитер, или аналогичное пятно.

Для длительного хранения слайдов, смонтировать червей в коммерчески доступных или самодельных анти-fade. Затем добавить крышку и печать края с лаком для ногтей. После лак для ногтей высохла, слайды могут быть забиты.

Во-первых, найти наиболее зрелых неоплодотвореных яйцеклеток, который сразу же примыкает к spermatheca, и еще не вступил либо spermatheca или матки. DAPI органов здесь предположительно одной хромосомы пар. Далее, сосредоточиться на ядре яйцеклетки и использовать микроскопа тонкой фокус медленно сканировать его, сверху вниз, при подсчете DAPI органов.

Дикие ооциты типа имеют в среднем шесть тел DAPI. Присутствие 12 тел DAPI указывает на то, что животные в этом штамме являются либо частичными, либо полными тетраплоидами. Анализируйте не менее 10 животных на штамм. Часто хромосомные пары будут очень близки или трогательны, поэтому количество тел DAPI часто меньше, чем фактическое количество хромосомных пар.