Zwemmen-Geïnduceerde Verlamming (SWIP) Assay: Een methode om dopamine-gemedieerde voortbeweging te kwantificeren in C. elegans

- Om de zwem-induced verlamming, of SWIP-test uit te voeren, breng L4 geënsceneerde C. elegans larven over naar een glazen spotplaat gevuld met vloeistof. Identificeer L4 hermafrodieten door de aanwezigheid van de zich ontwikkelende vulva. Een halvemaanvormige patch in het midden van het lichaam en een zweepachtige staart.

Om dopamine-gemedieerd zwemmen te beoordelen, registreert u de beweging van de worm die wordt gekenmerkt door C-vormig lichaamsbuig- en thrashing-gedrag. Meestal geven dopaminerge neuronen dopamine vrij in de synaptische spleet, die op zijn beurt dopaminereceptoren op de ontvangende cel bindt.

Zodra de boodschap wordt doorgegeven, dopamine wordt vrijgegeven uit de receptoren, en ongebonden neurotransmitters kunnen worden opgenomen door de dopaminerge neuron door middel van gespecialiseerde transporter eiwitten en hergebruikt.

Bij larven met veranderde dopamine-signalering, veroorzaakt door inactiverende mutaties in de dopaminetransporter of medicamenteuze behandelingen die de dopamine-afgifte verhogen, hoopt dopamine zich op in de synaptische spleet. Overtollige dopamine over stimuleert de dopaminereceptoren die het motorische programma verstoren en de larven verlamd laten. Larven die niet kunnen bewegen, zinken naar de bodem van de plaat.

In het voorbeeldprotocol zullen we gedetailleerde demonstraties zien van handmatige en geautomatiseerde SWIP-assays in C. elegans behandeld met amfetamine.

- Voeg voor handmatige beoordeling van SWIP 40 microliter regeloplossing met of zonder 0,5 millimol amfetamine toe aan een glazen spotplaat. Pluk onder een stereoscope 8 tot 10 late L4-fase wormen met een wimperpriem en dompel de plectrum onder in de put met de oplossing totdat de wormen van de plectrum afgaan en in de oplossing zwemmen.

Start de timer. Noteer het aantal wormen dat in de put wordt vrijgegeven en observeer en registreer het aantal wormen dat SWIP vertoont bij elke minuutmarkering gedurende in totaal 10 minuten.

Kopieer aan het einde van de procedure de onbewerkte gegevens naar een spreadsheet en bereken het percentage verlamde wormen door het aantal wormen dat op elke minuut verlamd is te delen door het totale aantal wormen dat tijdens de test is getest en zich vermenigvuldigt met 100. Kopieer de procentuele waarden naar grafiek- en statistische software en plot de gegevens met procentuele waarden van SWIP op de y-as en tijd op de x-as met behulp van de xy-grafiekindeling.

Statistische analyse tussen de met controle en amfetamine behandelde groepen en het tijdstip van behandeling kan worden uitgevoerd. Bijvoorbeeld door gebruik te maken van tweeweg ANOVA en post hoc analyse.

Voor geautomatiseerde analyse van zwemmen geïnduceerde verlamming, stel de camera, worm tracker software, en script om de tracking software analyse uit te voeren. En gebruik een wimper pick om een enkele late-stage L4 worm te plaatsen in een glazen spot plaat zoals eerder getoond.

Neem vervolgens zwemvideo's van één worm tegelijk op en gebruik de wormtrackersoftware om de frequentie van lichaamsbochten te berekenen. Volg het script dat is geleverd met de trackingsoftware om de frequentie van het slaan van de worm te verkrijgen en om warmtekaarten te genereren van de worm die gegevens afslacht.