Schwimmen-induzierte Lähmung (SWIP) Assay: Eine Methode zur Quantifizierung von Dopamin-vermittelter Fortbewegung bei C. elegans

- Um die schwimm-induced Lähmung durchzuführen, oder SWIP-Assay, übertragen L4 inszeniert Elegans Larven auf eine Glas-Spot-Platte mit Flüssigkeit gefüllt. Identifizieren L4 Hermaphrodite durch das Vorhandensein der sich entwickelnden Vulva. Ein halbmondförmiges Pflaster an der Mitte des Körpers, und ein peitschenartiger Schwanz.

Um Dopamin-vermitteltes Schwimmen zu bewerten, zeichnen Sie die Bewegung des Wurms auf, die durch C-förmiges Körperbiegungs- und Thrashing-Verhalten gekennzeichnet ist. Normalerweise setzen dopaminerge Neuronen Dopamin in den synaptischen Spalten frei, der wiederum Dopaminrezeptoren an die aufnehmende Zelle bindet.

Sobald die Nachricht weitergegeben wird, Dopamin wird von den Rezeptoren freigesetzt, und ungebundene Neurotransmitter können von der dopaminergen Neuron durch spezialisierte Transporter Proteine aufgenommen und wiederverwendet werden.

Bei Larven mit veränderter Dopamin-Signalisierung, verursacht durch inaktivierende Mutationen im Dopamin-Transporter oder medikamentöse Behandlungen, die Dopamin-Freisetzung erhöhen, Dopamin sammelt sich in der synaptischen Spalte. Überschüssiges Dopamin über stimuliert die Dopamin-Rezeptoren stören das Motorprogramm und lassen die Larven gelähmt. Larven, die nicht in der Lage sind, zu bewegen, werden auf den Boden der Platte sinken.

Im Beispielprotokoll werden detaillierte Vorführungen von manuellen und automatisierten SWIP-Assays in C. elegans gesehen, die mit Amphetamin behandelt werden.

- Zur manuellen Beurteilung von SWIP 40 Mikroliter Steuerlösung mit oder ohne 0,5-Millimolar-Amphetamin in eine Glas-Spotplatte geben. Unter einem Stereoskop 8 bis 10 späte L4-Bühnenwürmer mit einer Wimpernpickung pflücken und die Pick in den Brunnen, der die Lösung enthält, bis sich die Würmer von der Picke entfernen und in die Lösung schwimmen.

Starten Sie den Timer. Beachten Sie die Anzahl der Würmer, die in den Brunnen freigesetzt werden, und beobachten und notieren Sie die Anzahl der Würmer, die SWIP bei jeder Minutenmarke für insgesamt 10 Minuten ausstellen.

Kopieren Sie am Ende des Verfahrens die Rohdaten in eine Kalkulationstabelle und berechnen Sie den Prozentsatz der gelähmten Würmer, indem Sie die Anzahl der Würmer, die in jeder Minute gelähmt sind, durch die Gesamtzahl der würmer dividieren, die während des Tests getestet wurden, und multiplizieren Sie mit 100. Kopieren Sie die Prozentwerte in jede grafische und statistische Software und zeichnen Sie die Daten mit Prozentwerten von SWIP auf der y-Achse und der Zeit auf der x-Achse mit dem xy-Graphenformat.

Statistische Auswertungen zwischen den Kontroll- und Amphetamin-behandelten Gruppen und der Behandlungszeit können durchgeführt werden. Zum Beispiel durch zweiwege ANOVA- und Post-hoc-Analysen.

Für die automatisierte Analyse der schwimminduzierten Lähmung, richten Sie die Kamera, Wurm-Tracker-Software und Skript, um die Tracking-Software-Analyse auszuführen. Und verwenden Sie eine Wimpernauswahl, um einen einzelnen l4-Wurm im späten Stadium in eine Glas-Spotplatte zu platzieren, wie zuvor gezeigt.

Dann nehmen Sie Schwimmvideos von einem Wurm nach dem anderen auf, und verwenden Sie die Wurm-Tracker-Software, um die Häufigkeit der Körperbiegungen zu berechnen.