Test di paralisi indotta dal nuoto (SWIP): un metodo per quantificare la locomozione mediata dalla dopamina in C. elegans

- Per eseguire la paralisi nuoto-induced, o saggio SWIP, trasferire le larve di C. elegans messe in scena in C. elegans in una piastra di vetro riempita di liquido. Identificare gli ermafroditi L4 dalla presenza della vulva in via di sviluppo. Una macchia a forma di mezzaluna nel punto centrale del corpo e una coda simile a una frusta.

Per valutare il nuoto mediato dalla dopamina, registrare il movimento del verme caratterizzato da una flessione del corpo a forma di C e da un comportamento di thrashing. Di solito, i neuroni dopaminergici rilasciano dopamina nella fessura sinaptica, che a sua volta lega i recettori della dopamina sulla cellula ricevente.

Una volta trasmesso il messaggio, la dopamina viene rilasciata dai recettori e i neurotrasmettitori non vincolati possono essere ripresi dal neurone dopaminergico attraverso proteine specializzate del trasportatore e riutilizzati.

Nelle larve con segnalazione alterata della dopamina, causata da mutazioni inattivanti nel trasportatore di dopamina o trattamenti farmacologici che aumentano il rilascio di dopamina, la dopamina si accumula nella fessura sinaptica. L'eccesso di dopamina stimola i recettori della dopamina interferendo con il programma motorio e lasciando paralizzate le larve. Le larve che non sono in grado di muoversi affonderanno sul fondo del piatto.

Nel protocollo di esempio, vedremo dimostrazioni dettagliate di saggi SWIP manuali e automatizzati in C. elegans trattati con anfetamina.

- Per la valutazione manuale dell'SWIP, aggiungere 40 microlitri di soluzione di controllo con o senza anfetamina 0,5 millimolare in una piastra spot di vetro. Sotto uno stereoscopio, raccogliere da 8 a 10 vermi in fase L4 con un piccone per ciglia e immergere il piccone nel pozzo contenente la soluzione fino a quando i vermi non si spostano dal piccone e nuotano nella soluzione.

Avviare il timer. Annotare il numero di worm rilasciati nel pozzo e osservare e registrare il numero di worm che espongono SWIP a ogni minuto per un totale di 10 minuti.

Al termine della procedura, copiare i dati non elaborati in un foglio di calcolo e calcolare la percentuale di worm paralizzati dividendo il numero di worm paralizzati ad ogni minuto per il numero totale di worm testati durante il test e moltiplicando per 100. Copiare i valori percentuali in qualsiasi software grafico e statistico e tracciare i dati con i valori percentuali di SWIP sull'asse y e il tempo sull'asse x utilizzando il formato grafico xy.

È possibile eseguire l&analisi statistica tra i gruppi di controllo e trattati con anfetamine e il tempo di trattamento. Ad esempio, utilizzando l&ANOVA a due modi e l&analisi post hoc.

Per l'analisi automatizzata della paralisi indotta dal nuoto, impostate la fotocamera, il software worm tracker e lo script per eseguire l'analisi del software di tracciamento. E utilizzate una scelta di ciglia per posizionare un singolo worm L4 in fase avanzata in una lastra di vetro, come mostrato in precedenza.

Quindi, registrare i video di nuoto di un worm alla volta e utilizzare il software di monitoraggio dei worm per calcolare la frequenza delle curve del corpo. Seguendo lo script fornito con il software di tracciamento per ottenere la frequenza di thrashing del worm e generare mappe di calore dai dati di thrashing del worm.