Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- For å utføre svømming-induced lammelse, eller SWIP analyse, overføre L4 iscenesatt C. elegans larver til en glass spot plate fylt med væske. Identifiser L4 hermafroditter ved tilstedeværelsen av den utviklende vulva. En halvmåneformet patch på midten av kroppen, og en pisk-lignende hale.
For å vurdere dopaminmediert svømming, registrer ormens bevegelse preget av C-formet kroppsbøying og bankende oppførsel. Vanligvis frigjør dopamin nevroner dopamin i synaptisk kløft, som igjen binder dopaminreseptorer på mottakscellen.
Når meldingen er videreført, frigjøres dopamin fra reseptorene, og ubundne nevrotransmittere kan tas opp av dopaminerge nevron gjennom spesialiserte transportørproteiner og gjenbrukes.
I larver med endret dopaminsignalering, forårsaket av inaktivering av mutasjoner i dopamintransportøren eller legemiddelbehandlinger som øker dopaminfrigjøringen, akkumuleres dopamin i synaptisk kløft. Overskytende dopamin over stimulerer dopaminreseptorene som forstyrrer motorprogrammet og forlater larvene lammet. Larver som ikke klarer å bevege seg, vil synke til bunnen av platen.
I eksempelprotokollen vil vi se detaljerte demonstrasjoner av manuelle og automatiserte SWIP-analyser i C. elegans behandlet med amfetamin.
- For manuell vurdering av SWIP, tilsett 40 mikroliter kontrollløsning med eller uten 0,5 millimolar amfetamin i en glassflekkplate. Under et stereoskop velger du 8 til 10 sene L4-trinns ormer med øyevippeplukk, og senk plukket i brønnen som inneholder oppløsningen til ormene beveger seg av plukket og svømmer inn i løsningen.
Start tidtakeren. Legg merke til antall ormer som slippes ut i brønnen, og observer og registrer antall ormer som viser SWIP ved hvert minuttmerke i totalt 10 minutter.
På slutten av prosedyren kopierer du rådataene til et regneark og beregner prosentandelen av ormer som er lammet, ved å dele antall ormer lammet i hvert minutt med det totale antallet ormer som er testet gjennom hele analysen, og multiplisere med 100. Kopier prosentverdiene til en hvilken som helst grafer og statistisk programvare, og tegn dataene med prosentverdier for SWIP på y-aksen og tiden på x-aksen ved hjelp av xy-formatet.
Statistisk analyse blant kontroll- og amfetaminbehandlede grupper og behandlingstidspunktet kan for eksempel utføres.
For automatisert analyse av svømming indusert lammelse, sette opp kameraet, orm tracker programvare, og skript for å kjøre sporing programvare analyse. Og bruke en øyenvippe plukke å plassere en enkelt sen-stage L4 orm i en glass spot plate som vist tidligere.
Ta deretter opp svømmevideoer av en orm om gangen, og bruk ormesporerprogramvaren til å beregne frekvensen av kroppsbøyer. Etter skriptet som følger med sporingsprogramvaren for å oppnå ormen thrashing frekvens og for å generere varmekart fra ormen thrashing data.
