Siminducerad förlamning (SWIP) Analys: En metod för att kvantifiera dopaminmedierad rörelse i C. elegans

- För att utföra den sim-i-nduced förlamningen, eller SWIP-analysen, överföra L4 iscensatt C. elegans larver till en glasfläckplatta fylld med vätska. Identifiera L4 hermafroditer genom närvaron av den utvecklande vulva. En halvmåneformad fläck vid kroppens mittpunkt och en piska-liknande svans.

För att bedöma dopaminmedierad simning, registrera maskens rörelse som kännetecknas av C-formad kroppsbockning och thrashing beteende. Vanligtvis släpper dopaminerga nervceller dopamin i den synaptiska klyftan, som i sin tur binder dopaminreceptorer på den mottagande cellen.

När meddelandet har vidarebefordrats frigörs dopamin från receptorerna, och obundna signalsubstanser kan tas upp av dopaminerga nervceller genom specialiserade transportörproteiner och återanvändas.

I larver med förändrad dopaminsignalering, orsakad av inaktiverande mutationer i dopamintransportören eller läkemedelsbehandlingar som ökar dopaminfrisättningen, ackumuleras dopamin i den synaptiska klyftan. Överskott av dopamin över stimulerar dopaminreceptorerna som stör motorprogrammet och lämnar larverna förlamade. Larver som inte kan röra sig kommer att sjunka till botten av plattan.

I exempelprotokollet kommer vi att se detaljerade demonstrationer av manuella och automatiserade SWIP-analyser i C. elegans behandlade med amfetamin.

- För manuell bedömning av SWIP, tillsätt 40 mikroliter styrlösning med eller utan 0,5 millimolärt amfetamin i en glasfläckplatta.

Starta timern. Notera antalet maskar som släpps ut i brunnen och observera och registrera antalet maskar som uppvisar SWIP vid varje minutmarkering i totalt 10 minuter.

I slutet av proceduren kopierar du rådata till ett kalkylblad och beräknar procenten av maskar som är förlamade genom att dividera antalet maskar som är förlamade i varje minut med det totala antalet maskar som testats under hela analysen och multiplicera med 100. Kopiera procentvärdena till alla graf- och statistiska program och rita data med procentvärden för SWIP på y-axeln och tiden på x-axeln med hjälp av xy-diagramformatet.

Statistisk analys bland de kontroll- och amfetaminbehandlade grupperna och behandlingstiden kan till exempel utföras.

För automatiserad analys av simning inducerad förlamning, ställ in kameran, mask tracker programvara och skript för att köra spårning programvara analys.

Spela sedan in simvideor av en mask i taget och använd worm tracker-programvaran för att beräkna frekvensen av kroppsböjningar.