RNAi Plating for C. elegans Feeding: A Technique to Induce Target dsRNA Expression in E. coli

- Bei C. elegans kann RNAi durch Diepernvonschnecken bakterien induziert werden, die doppelsträngige RNA oder dsRNA aus einem rekombinanten DNA-Plasmid exprimieren.

Zunächst wachsen Tetracyclin-resistente HT115 E. coli transfiziert mit L4440 Plasmid über Nacht auf selektiven LB-Agarplatten, die Tetracyclin und Ampicillin enthalten, oder sein funktionelles analoges Carbenicillin. Zusätzlich zur Ziel-DNA enthält das Plasmid ein Gen zur Ampicillinresistenz. Nur Bakterienkolonien, die das Plasmid erben, können in Gegenwart dieser Antibiotika wachsen.

Als nächstes ernten Bakterienkolonien und erweitern sie in flüssigem LB-Medium auf die gewünschte Konzentration. Um die dsRNA-Expression zu induzieren, übertragen Sie die Bakterienlösung auf das vorbereitete Nematoden-Wachstumsmedium oder NGM, Agarplatten, die IPTG enthalten.

In diesem Expressionssystem imitiert IPTG Lactose, um den Lac-Repressor zu inaktivieren, der die Expression von T7-RNA-Polymerase ermöglicht. Am Plasmid wird die Ziel-DNA-Expression durch zwei konvergente T7-Promotoren reguliert.

Schließlich verwendet der Wurm die Sequenzinformationen aus der aufgenommenen dsRNA, um endogene mRNAs mit komplementären Sequenzen zu regulieren. In diesem Experiment bereiten wir RNAi-Platten mit transgenem E. coli für die C. elegans-Fütterung vor.

- Für die RNAi-Platten 6-Zentimeter-Platten mit NGM-Agar mit IPTG und Carbenicillin laden. 24 bis 48 Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln trocknen lassen. Dann bis zu 14 Tage auf 4 Grad Celsius übertragen.

Als nächstes Streifen selektive Platten mit Carbenicillin und Tetracyclin mit RNAi Bakterien Klone mit L4440 Plasmid mit dem lin-53 Gen. Verwenden Sie ein dreiphasiges Streifenmuster und achten Sie darauf, eine leere Vektorkontrolle zu verzieren. Dann wachsen die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius.

Am nächsten Tag, wählen Sie mindestens drei einzelne Kolonien und impfen sie jede von ihnen in eine separate Kulturröhre mit 2 Milliliter LB mit Carbenicillin ergänzt, aber nicht Tetracyclin. Planen Sie, drei gesunde Kulturen pro Zustand haben.

Als nächstes wachsen die Kulturen über Nacht bei 37 Grad Celsius, bis sie eine optische Dichte von 600 Nanometern von 0,6 bis 0,8 erreichen. Dann fügen Sie 500 Mikroliter jeder Bakterienkultur zu einer 6-Zentimeter-NGM-Agar-RNAi-Platte hinzu. Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei Raumtemperatur im Dunkeln.