Encyclopedia of Experiments: Biology
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- Em C. elegans, rnAi pode ser induzido por bactérias de minhoca que expressam RNA ou dsRNA de duplas-encalhados a partir de um plasmídeo de DNA recombinante.
Para começar, cresça HT115 E. coli resistente à tetraciclina transfectada com L4440 plasmídeo durante a noite em placas de ágar LB seletivas contendo tetraciclina e ampicillina, ou sua carbenicilina analógica funcional. Além do DNA alvo, o plasmídeo contém um gene para resistência à ampicilina.
Em seguida, colher colônias de bactérias e expandi-las em meio líquido LB para a concentração desejada. Para induzir a expressão dsRNA, transfira a solução de bactérias para o meio de crescimento de nematoide preparado, ou NGM, placas de ágar contendo IPTG.
Neste sistema de expressão, o IPTG imita a lactose para inativar o repressor de lac que permite a expressão de polimerase T7 RNA. No plasmídeo, a expressão de DNA alvo é regulada por dois promotores T7 convergentes. Consequentemente, sequências de sentido e anti-sentido são transcritas levando à expressão do dsRNA.
Finalmente, o worm usa as informações sequenciais do dsRNA ingerido para desregular os mRNAs endógenos com sequências complementares. Neste experimento, prepararemos placas RNAi com E. coli transgênica para alimentação de C. elegans.
- Para as placas RNAi, carregue placas de 6 centímetros com ágar NGM contendo IPTG e carbenicilina. Deixe-as secar por 24 a 48 horas em temperatura ambiente no escuro.
Em seguida, as placas seletivas de raia contendo carbenicilina e tetraciclina com clones de bactérias RNAi com plasmídeoS L440 carregando o gene lin-53. Use um padrão de listramento trifásico e certifique-se de emplacar um controle vetorial vazio.
No dia seguinte, escolha pelo menos três colônias simples e inocula cada uma delas em um tubo de cultura separado com 2 mililitros de LB complementados com carbenicilina, mas não tetraciclina. Plano para ter três culturas saudáveis por condição.
Em seguida, cresça as culturas durante a noite a 37 graus Celsius até atingirem uma densidade óptica de 600 nanômetros de 0,6 a 0,8. Em seguida, adicione 500 microliters de cada cultura bacteriana a uma placa ágar RNAi de 6 centímetros.
