Encyclopedia of Experiments: Biology
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- En C. elegans, el ARN puede ser inducido por la alimentación de bacterias gusanos que expresan ARN o dsRNA de doble hebra de un plásmido de ADN recombinante.
Para empezar, cultivar HT115 E. coli resistente a la tetraciclina transfectado con plásmido L4440 durante la noche en placas selectivas de agar LB que contienen tetraciclina y ampicilina, o su carbenicilina analógica funcional. Además del ADN objetivo, el plásmido contiene un gen para la resistencia a la ampicilina.
A continuación, cosechar colonias de bacterias y expandirlas en medios LB líquidos a la concentración deseada. Para inducir la expresión dsRNA, transfiera la solución bacteriana al medio de crecimiento de nematodos preparados, o NGM, placas de agar que contengan IPTG.
En este sistema de expresión, IPTG imita la lactosa para inactivar el represor de cordones que permite la expresión de arn polimerasa T7. En el plásmido, la expresión de ADN objetivo está regulada por dos promotores convergentes de T7. En consecuencia, las secuencias de sentido y anti-sentido se transcriben dando lugar a la expresión de dsRNA.
Por último, el gusano utiliza la información de secuencia del dsRNA ingerido para reducir los ARN endógenos con secuencias complementarias.
- Para las placas RNAi, cargue placas de 6 centímetros con agar NGM que contenga IPTG y carbenicilina. Déjelas secar durante 24 a 48 horas a temperatura ambiente en la oscuridad.
A continuación, placas selectivas de rayas que contienen carbenicilina y tetraciclina con clones de bacterias RNAi con plásmido L4440 que transporta el gen lin-53. Utilice un patrón de rayado trifásico y asegúrese de chapar un control vectorial vacío.
Al día siguiente, escoge al menos tres colonias individuales e inocula cada una de ellas en un tubo de cultivo separado con 2 mililitros de LB complementados con carbenicilina, pero no tetraciclina.
A continuación, cultivar los cultivos durante la noche a 37 grados Centígrados hasta que alcancen una densidad óptica de 600 nanómetros de 0,6 a 0,8. Luego, añadir 500 microlitros de cada cultivo bacteriano a una placa RNAi de agar NGM de 6 centímetros. Incubar las placas durante la noche a temperatura ambiente en la oscuridad.
