Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- للبدء، أضف كاربينسيلين و IPTG ميليمولار واحد للسيطرة واختبار قوارير الثقافة التي تحتوي على وسائل الإعلام القاعدية S. تدور أنبوب يحتوي على اليرقات في مرحلة النمو الأولى، وتسمى أيضا يرقات L1، لبضع دقائق.
أضف بكتيريا RNAi التي تحمل بلازميد RNAi غير محدد إلى قارورة التحكم والبكتيريا ذات ال RNAi التي تستهدف الجينات إلى قارورة الاختبار.
دع اليرقات تنمو مع اهتزاز مستمر لضمان الأكسجين المناسب. تتغذى اليرقات على البكتيريا. داخل اليرقة ، يرتبط الحمض النووي الريبي التدخلي الصغير بالحمر النووي الريبي التكميلي الذي ينتجه الجين المستهدف ويمنع التعبير البروتيني.
في بروتوكول المثال ، سنعالج يرقات L1 مع RNAi التي تستهدف جين daf-2 ، في الثقافة السائلة.
- لبدء العلاج، أضف 207.45 ملليلتر من قارورة S القاعدية مع كواشف إضافية كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب إلى قارورة ثقافة فرنباخ 2800 ملليلتر.
أخرج ال L1s من حاضنة 25 درجة مئوية ونقلها إلى 15 أنبوب ملليلتر.
بعد ذلك ، أضف 50،000 دودة لجمع الديدان الصغيرة و 100،000 دودة لجمع الديدان القديمة في أربع قوارير ثقافة فرنباخ أعدت في الخطوة السابقة.
بعد إضافة البكتيريا، واستكمال ثقافة دودة مع القاعدية S ليصل الحجم الإجمالي إلى 300 ملليلتر. احتضان ثقافة دودة في 25 درجة مئوية في حاضنة تهتز مع 150 دورة في الدقيقة حتى جمع.
