Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Til at begynde med tilsættes carbenicillin og en millimolar IPTG til kontrol og testkulturflasker indeholdende S basal media. Spin et rør, der indeholder larver i vækststadie et, også kaldet L1 larver, i et par minutter. Fjern nu supernatanten og læg to mikroliter L1'er på en agarplade. Placer pladen under et dissekerende mikroskop og tæl antallet af larver.
Tilføj RNAi bakterier transporterer en ikke-specifik RNAi plasmid til kontrol kolben og bakterier med gen-målretning RNAi til test kolben. Mængden af bakterier tilsættes bør stå i forhold til antallet af orme.
Lad larverne vokse med kontinuerlig rysten for at sikre korrekt iltning. Larverne lever af bakterierne. Inde i larven binder det lille forstyrrende RNA sig til det komplementære mRNA produceret af det målrettede gen og hæmmer proteinudtryk. Endelig undersøge ormene for din fænotype af interesse.
I eksempelprotokollen vil vi behandle L1 larver med RNAi rettet mod daf-2-genet i flydende kultur.
- Til at begynde behandlingen tilsættes 207,45 milliliter S basale medier med yderligere reagenser som beskrevet i den ledsagende tekstprotokol til en 2.800 milliliter Fernbach-dyrkningskolbe. Tilsæt en endelig koncentration på 50 mikrogram pr. milliliter carbenicillin og 1 millimolar IPTG, og luk kolben med en membranskruehætte.
Tag L1'erne ud af 25 grader Celsius inkubatoren og overfør dem til 15 milliliter rør. Centrifuge L1'erne ved 1.900 gange g i tre minutter. Efter spinding skal du fjerne supernatanten.
Dernæst tilsættes 50.000 orme til den unge ormsamling og 100.000 orme til den gamle ormsamling i fire Fernbach-kulturkolber tilberedt i det foregående trin. Tilføj derefter kontrol RNAi-bakterier og RNAi-bakterier for interessegenet proportionalt med antallet af orme.
Efter tilsætning af bakterier, komplet orm kultur med S basal at bringe det samlede volumen til 300 milliliter. Inkuber ormen kultur ved 25 grader Celsius i en rystende inkubator med 150 RPM indtil indsamling.
