Encyclopedia of Experiments: Biology
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- शुरू करने के लिए, एस बेसल मीडिया युक्त संस्कृति फ्लास्क को नियंत्रित करने और परीक्षण करने के लिए कार्बेनेसिलिन और एक मिलीमोलर आईपीटीजी जोड़ें। विकास चरण एक पर लार्वा युक्त ट्यूब स्पिन करें, जिसे कुछ मिनटों के लिए एल1 लार्वा भी कहा जाता है। अब सुपरनैंट को हटा दें और एक आगर प्लेट पर L1s के दो माइक्रोलीटर रखें। एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे प्लेट रखें और लार्वा की संख्या गिनती करें।
RNAi बैक्टीरिया को नियंत्रण फ्लास्क और बैक्टीरिया के लिए एक गैर-विशिष्ट आरएनएआई प्लाज्मिड को जोड़ें, जिसमें परीक्षण फ्लास्क में जीन-लक्षित आरएनएआई है। जोड़ा गया बैक्टीरिया की मात्रा कीड़े की संख्या के आनुपातिक होनी चाहिए।
लार्वा को उचित ऑक्सीजन सुनिश्चित करने के लिए निरंतर झटकों के साथ बढ़ने दें। लार्वा बैक्टीरिया को खिलाता है लार्वा, लार्वा के अंदर, छोटे हस्तक्षेप आरएनए लक्षित जीन द्वारा उत्पादित पूरक एमआरएनए से बांधता है और प्रोटीन अभिव्यक्ति को रोकता है। अंत में, आपके फेनोटाइप के हित के लिए कीड़े की जांच करें।
उदाहरण प्रोटोकॉल में, हम तरल संस्कृति में डीएएफ-2 जीन को लक्षित करते हुए आरएनएआई के साथ एल1 लार्वा का इलाज करेंगे।
- उपचार शुरू करने के लिए, अतिरिक्त अभिकर्मकों के साथ एस बेसल मीडिया के 207.45 मिलीलीटर जोड़ें जैसा कि 2,800 मिलीलीटर फर्नबाख कल्चर फ्लास्क में साथ पाठ प्रोटोकॉल में वर्णित है। 50 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर कार्बेनिकिन और आईपीटीजी के 1 मिलीमोलर की अंतिम एकाग्रता जोड़ें, और एक झिल्ली पेंच कैप के साथ फ्लास्क को बंद करें।
L1s को 25 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर से बाहर निकालें और उन्हें 15 मिलीलीटर ट्यूबों में स्थानांतरित करें। 1,900 बार जी पर एल1एस को तीन मिनट के लिए सेंट्रलाइज करें। कताई के बाद, सुपरनैंट को हटा दें। एक माइक्रोस्कोप के तहत, प्रति दो माइक्रोलीटर L1s की गिनती करें, और औसत संख्या कम से कम नौ बूंदों से प्राप्त की जाए।
इसके बाद, युवा कृमि संग्रह के लिए ५०,० कीड़े और पिछले चरण में तैयार चार फर्नबाख संस्कृति फ्लास्क में वृद्ध कृमि संग्रह के लिए १००,० कीड़े जोड़ें । फिर कीड़े की संख्या के आनुपातिक रूप से ब्याज के जीन के लिए नियंत्रण RNAi बैक्टीरिया और RNAi बैक्टीरिया जोड़ें ।
बैक्टीरिया जोड़ने के बाद, एस बेसल के साथ पूर्ण कीड़ा संस्कृति 300 मिलीलीटर के लिए कुल मात्रा लाने के लिए। संग्रह तक 150 आरपीएम के साथ एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में 25 डिग्री सेल्सियस पर कीड़ा संस्कृति को इनक्यूबेट करें।
