液体培養におけるRNAi摂食:C.エレガンスにおける遺伝子発現をノックダウンするハイスループット法

- まず、カルベニシリンと1ミリモルのIPTGを加えて、S基底培地を含む培養フラスコを制御および試験します。 L1幼虫とも呼ばれる成長段階1で幼虫を含むチューブを数分間回転させます。

対照フラスコに非特異的RNAiプラスミドを運ぶRNAi細菌と、遺伝子標的RNAiを有する細菌を試験フラスコに加える。

正しい酸素を確保するために、幼虫は連続的に揺れ動き、幼虫は細菌に餌を与え、幼虫の中では、小さな干渉RNAが標的遺伝子によって産生される相補的mRNAに結合し、タンパク質発現を阻害する。

このプロトコル例では、液体培養中のdaf-2遺伝子を標的とするRNAiを用いてL1幼虫を治療する。

- 治療を開始するには、付随するテキストプロトコルに記載されている追加の試薬で207.45ミリリットルのS基底培地を2,800ミリリットルのフェルンバッハ培養フラスコに加え、カルベニシリン1ミリリットル当たり50マイクログラム、IPTG1ミリモルを加え、膜ねじキャップでフラスコを閉じます。

L1を摂氏25度のインキュベーターから取り出し、15ミリリットルのチューブに移し、回転後にL1を1,900倍gで3分間遠心分離します。

次に、若いワームコレクションに50,000ワーム、熟成ワームコレクション用の100,000ワームを前のステップで作成した4つのフェルンバッハ培養フラスコに加えます。

細菌を加えた後、S基底を使用してワーム培養を完了し、総体積を300ミリリットルにします。