Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Til å begynne med, legg til carbenicillin og en millimolar IPTG for å kontrollere og teste kulturflasker som inneholder S basal media. Spinn et rør som inneholder larver på vekststadium en, også kalt L1 larver, i noen minutter. Nå fjern supernatanten og plasser to mikroliter av L1s på en agarplate. Plasser platen under et dissekeringsmikroskop og tell antall larver.
Tilsett RNAi-bakterier som bærer en ikke-spesifikk RNAi-plasmid til kontrollflasken og bakterier med genmålretting av RNAi til testflasken. Mengden bakterier som tilsetts, bør være proporsjonal med antall ormer.
La larvene vokse med kontinuerlig risting for å sikre riktig oksygenering. Larvene spiser på bakteriene. Inne i larven binder den lille forstyrrende RNA seg til den komplementære mRNA produsert av det målrettede genet og hemmer proteinuttrykk. Til slutt, undersøk ormene for din fenotype av interesse.
I eksempelprotokollen vil vi behandle L1 larver med RNAi rettet mot daf-2-genet, i flytende kultur.
- For å starte behandlingen, legg til 207,45 milliliter S basal media med ekstra reagenser som beskrevet i den medfølgende tekstprotokollen til en 2800 milliliter Fernbach kulturflaske. Legg til en sluttkonsentrasjon på 50 mikrogram per milliliter carbenicillin og 1 millimolar IPTG, og lukk kolben med en membranskruehette.
Ta L1-ene ut av 25 grader Celsius-inkubatoren og overfør dem til 15 milliliterrør. Sentrifuger L1-ene ved 1900 ganger g i tre minutter. Etter spinning, fjern supernatanten. Under et mikroskop teller du L1-ene per to mikroliter, og gjennomsnittlig tallene oppnådd fra minst ni dråper.
Deretter legger du til 50.000 ormer for den unge ormesamlingen og 100.000 ormer for den aldrende ormesamlingen i fire Fernbach-kulturflasker tilberedt i forrige trinn. Deretter legger du til kontroll RNAi-bakterier og RNAi-bakterier for genet av interesse proporsjonalt med antall ormer.
Etter å ha lagt til bakterier, komplett ormkultur med S basal for å bringe det totale volumet til 300 milliliter. Inkuber ormekulturen ved 25 grader Celsius i en ristende inkubator med 150 RPM til samling.
