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RNAi Alimentando-se em Cultura Líquida

 
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RNAi Alimentando-se em Cultura Líquida: Um Método de Alto Rendimento para Derrubar a Expressão Genética em C. elegans

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- Para começar, adicione carbenicilina e um IPTG mililitro para controlar e testar frascos de cultura contendo mídia basal S. Gire um tubo contendo larvas no estágio um de crescimento, também chamado de larvas L1, por alguns minutos. Agora remova o supernatante e coloque dois microlitros de L1s em uma placa de ágar. Coloque a placa sob um microscópio dissecando e conte o número de larvas.

Adicione bactérias RNAi carregando um plasmídeo RNAi não específico ao frasco de controle e bactérias com gene-targeting RNAi ao frasco de teste. A quantidade de bactérias adicionadas deve ser proporcional ao número de vermes.

Deixe as larvas crescerem com agitação contínua para garantir a oxigenação adequada. As larvas se alimentam das bactérias. Dentro da larva, o pequeno RNA interferindo se liga ao mRNA complementar produzido pelo gene alvo e inibe a expressão proteica. Por fim, examine os vermes para o seu fenótipo de interesse.

No protocolo de exemplo, trataremos larvas L1 com RNAi visando o gene daf-2, na cultura líquida.

- Para iniciar o tratamento, adicione 207,45 mililitros de mídia basal S com reagentes adicionais como descrito no protocolo de texto que acompanha um frasco de cultura Fernbach de 2.800 mililitros. Adicione uma concentração final de 50 microgramas por mililitro de carbenicilina e 1 milimolato de IPTG, e feche o frasco com uma tampa de parafuso de membrana.

Retire os L1s da incubadora Celsius de 25 graus e transfira-os para tubos de 15 mililitros. Centrífuga os L1s a 1.900 vezes g por três minutos. Depois de girar, remova o supernante. Sob um microscópio, conte os L1s por dois microlitros, e média dos números obtidos de pelo menos nove gotas.

Em seguida, adicione 50.000 vermes para a coleção de vermes jovens e 100.000 vermes para a coleta de vermes envelhecidos em quatro frascos de cultura fernbach preparados na etapa anterior. Em seguida, adicione o controle bactérias RNAi e bactérias RNAi para o gene de interesse proporcionalmente ao número de vermes.

Depois de adicionar bactérias, cultura completa de vermes com S basal para trazer o volume total para 300 mililitros. Incubar a cultura do verme a 25 graus Celsius em uma incubadora de agitação com 150 RPM até a coleta.

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