Encyclopedia of Experiments: Biology
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- Para empezar, añadir carbenicilina y un IPTG mililitro para controlar y probar los matraces de cultivo que contienen medios basales S. Gire un tubo que contenga larvas en la primera etapa de crecimiento, también llamado larvas L1, durante unos minutos.
Añadir bacterias RNAi portadoras de un plásmido RNAi no específico al matraz de control y bacterias con RNAi objetivo genético al matraz de prueba. La cantidad de bacterias añadidas debe ser proporcional al número de gusanos.
Deje que las larvas crezcan con agitación continua para asegurar una oxigenación adecuada. Las larvas se alimentan de las bacterias.
En el protocolo de ejemplo, trataremos las larvas L1 con RNAi dirigidos al gen daf-2, en cultivo líquido.
- Para comenzar el tratamiento, añadir 207,45 mililitros de medios basales S con reactivos adicionales como se describe en el protocolo de texto adjunto a un matraz de cultivo Fernbach de 2.800 mililitros. Añadir una concentración final de 50 microgramos por mililitro de carbenicilina y 1 mililitro de IPTG, y cerrar el matraz con una tapa de tornillo de membrana.
Saca los L1 de la incubadora de 25 grados Celsius y transfiéralos a tubos de 15 mililitros. Centrifuga los L1s a 1.900 veces g durante tres minutos.
A continuación, añadir 50.000 gusanos para la colección de gusanos jóvenes y 100.000 gusanos para la recolección de gusanos envejecidos en cuatro frascos de cultivo Fernbach preparados en el paso anterior.
Después de añadir bacterias, completa el cultivo de gusanos con S basal para llevar el volumen total a 300 mililitros. Incuba el cultivo del gusano a 25 grados Celsius en una incubadora temblorosa con 150 RPM hasta la recolección.
