Vier-Wege-Olfactometer-Assay: Eine Methode zur Bewertung von Odorant-Cued-Responses in Drosophila

- Ein Vier-Wege-Olfactometer ist eine geschlossene Kammer mit Einweg-Ports an jeder Ecke, durch die es bis zu vier Gerüche liefern kann, Quadranten mit unterschiedlichen Geruchsprofilen. Beginnen Sie ein Experiment, indem Sie wache Fliegen in die Kammer übertragen. Vermeiden Sie Anästhesie, da dies ihr Verhalten während des Experiments beeinflussen kann.

Setzen Sie die Fliegen der sauberen Luft aus und beobachten Sie ihre Bewegungen, um sicherzustellen, dass keine Geruchsstoffe das Olfactometer kontaminieren und das Flugverhalten beeinflussen. Bereiten Sie dann die Testgeruchsmittel in separaten Fläschchen vor und verbinden Sie sie mit der Hauptkammer durch die Einweganschlüsse. Setzen Sie die Fliegen für einen vordefinierten Zeitraum den Geruchsstoffen aus und entfernen Sie den Reiz nach Abschluss der Studie.

Fliegen neigen dazu, Quadranten mit abweisenden Gerüchen zu vermeiden, während sie sich in Viererrichtungen mit attraktiven Gerüchen bewegen. Messen Sie die geruchsgerüsenen Verhaltensreaktionen der Fliegen, indem Sie ihre Positionen im Laufe der Zeit verfolgen, während sie das Olfactometer erforschen.

Im folgenden Protokoll verwenden wir ein Vier-Quadranten-Olfactometer mit einem Luftzufuhrsystem, um das Flugverhalten als Reaktion auf Ethylpropionat, ein abweisendes Geruchsmittel und Apfelessig zu analysieren, was attraktiv ist.

- Mindestens fünf Minuten im Voraus, schalten Sie den Temperaturregler ein und stellen Sie ihn auf 25 Grad Celsius. Dann verbinden Sie die Geruchskammern mit der Arena über ein Kunststoffrohr. Überprüfen Sie die Luftdurchflussrate in jedem Quadranten der Arena mit einem elektronischen Durchflussmesser. Stellen Sie sicher, dass die Steuerung und Geruch und Luftströme beide mit 100 Milliliter pro Minute laufen.

- Fliegen sind sehr empfindlich auf Luftstrom, und es ist wichtig, dass der Luftstrom für jeden Quadranten vor jedem Experiment überprüft wird.

- Reinigen Sie nun die Arena und die Glasplatten mit 70% Ethanol. Wischen Sie alle Teile zwei- bis dreimal ab und lassen Sie sie vor dem Fortfahren vollständig lufttrocknen. Als nächstes klemmen Sie die Glasplatten in die Arena. Dann übertragen Sie die Fliegen ohne Anästhesie in die Arena. Mit der Schwerkraft lassen Sie sie durch das Loch in eine der Glasplatten eindringen und dann das Loch mit einem kreisförmigen Netz bedecken.

Legen Sie nun die fliegende Arena in die lichtdichte Kammer. Dann verbinden Sie die vier Steuerluftströme an jede Arena-Ecke. Schließen Sie die Tür der Kammer und lassen Sie die Fliegen für 10 bis 15 Minuten an die neue Umgebung gewöhnen.

Führen Sie nach der Akklimatisierungsphase ein 5- bis 10-minütiges Kontrollexperiment durch, bei dem Fliegen vier Kontrollluftströmen ausgesetzt sind. Es ist wichtig, die Daten jetzt sofort zu analysieren.

- Es ist wichtig, das Verhalten von Kontrollfliegen zu testen, um nur saubere Luft. Dies wird schnell überprüfen, dass alle Hintergrundbedingungen normal sind. Leckierendes Licht, Temperaturungleichgewicht, gekippte Arena, oder eine Geruchskontamination kann alle Probleme verursachen.

- Falls erforderlich, entsorgen Sie die Fliegen und reinigen Sie die Arena wieder. Wenn eine Geruchsbelästigung vermutet wird, ersetzen Sie alle Schläuche. Wiederholen Sie den Kontrolltest mit neuen Kohorten, bis die Tiere keine Präferenz für einen der vier Quadranten zeigen. Dann schließen Sie die Testgeruchskammer mit dem Setup mit einem Drei-Wege-Ventil an, oder schließen Sie den Schlauch wieder an und führen Sie ein Testexperiment für 5 bis 10 Minuten durch.

Zwischen den Tests, entsorgen Sie die Fliegen, reinigen Sie die Arena und Glasplatten mit 70% Ethanol, und ersetzen Sie die Steckverbinderrohre. Halten Sie den trockenen Luftstrom gehen, um kontinuierlich zu spülen das System. Aus Effizienz, ist es gut, zwei Arenen haben, so dass die Reinigung während der Läufe durchgeführt werden kann.

- Wenn mehrere Experimente am selben Tag durchgeführt werden, achten Sie auf extreme Sorgfalt, um sicherzustellen, dass kein Geruch aus einem vorherigen Lauf im System bleibt. Dies ist normalerweise kein Problem mit niedrigen Konzentrationen von Geruchs- oder CO2-Konzentrationen. Aber für hochkonzentrierte Reize kann bis zu einem 24-Stunden-Abstand zwischen den Versuchsläufen erforderlich sein.