Ensayo de olfatómetro de cuatro vías: un método para evaluar las respuestas de olor en Drosophila

- Un olfatómetro de cuatro vías es una cámara cerrada con puertos unidireccionales en cada esquina, a través de los cuales puede emitir hasta cuatro olores, creando cuadrantes con distintos perfiles de olor. Comienza un experimento transfiriendo moscas despiertas a la cámara. Evite la anestesia, ya que esto puede afectar su comportamiento durante el experimento.

Exponga las moscas al aire limpio y observe sus movimientos para asegurarse de que ningún odorante contamine el olfatómetro y afecte el comportamiento de las moscas. Luego, prepare los odorantes de prueba en viales separados y conéctelos a la cámara principal a través de los puertos unidireccionales. Exponga las moscas a los odorantes durante un período predefinido, eliminando el estímulo una vez finalizado el ensayo.

Las moscas tienden a evitar los cuadrantes con olores repelentes mientras se desplazan y se posan en cuadrantes con olores atractivos. Mida las respuestas conductuales de las moscas a las señales de olor rastreando sus posiciones a lo largo del tiempo mientras exploran el olfatómetro.

En el siguiente protocolo, utilizaremos un olfatómetro de cuatro cuadrantes con un sistema de suministro de aire para analizar el comportamiento de las moscas en respuesta al propionato de etilo, un odorante repelente, y al vinagre de sidra de manzana, que es atractivo.

- Con al menos cinco minutos de antelación, encienda el controlador de temperatura y ajústelo a 25 grados centígrados. Luego, conecte las cámaras de odorante a la arena a través de un tubo de plástico. Verifique el caudal de aire en cada cuadrante de la arena utilizando un medidor de flujo electrónico. Asegúrese de que el control y las corrientes de olor y aire funcionen a 100 mililitros por minuto.

- Las moscas son muy sensibles al flujo de aire, y es fundamental que el flujo de aire de cada cuadrante se verifique antes de cada experimento.

- Ahora, limpie la arena y las placas de vidrio con etanol al 70%. Limpie todas las piezas dos o tres veces y deje que se sequen completamente al aire antes de continuar. A continuación, sujete las placas de vidrio a la arena. Luego, transfiera las moscas a la arena sin anestesia. Usando la gravedad, déjelos entrar a través del orificio en una de las placas de vidrio y luego cubra el orificio con una malla circular.

Ahora, coloque la arena cargada de moscas en la cámara hermética a la luz. Luego, conecte las cuatro corrientes de aire de control a cada esquina de la arena. Cierre la puerta de la cámara y deje que las moscas se aclimaten al nuevo entorno durante 10 a 15 minutos.

Después del período de aclimatación, realice un experimento de control de 5 a 10 minutos en el que las moscas se expongan a cuatro corrientes de aire de control. Ahora es esencial analizar los datos de inmediato. Si las moscas no se distribuyen uniformemente en la arena, la arena debe reiniciarse.

- Es fundamental probar el comportamiento de las moscas de control para limpiar el aire. Esto verificará rápidamente que todas las condiciones de fondo sean normales. Las fugas de luz, el desequilibrio de temperatura, la inclinación de la arena o la contaminación por olores pueden causar problemas.

- Si es necesario, desecha las moscas y vuelve a limpiar la arena. Si se sospecha de una contaminación por odorante, reemplace todos los tubos. Continúe repitiendo la prueba de control con nuevas cohortes hasta que los animales no muestren preferencia por ninguno de los cuatro cuadrantes. Luego, conecte la cámara de odorante de prueba a la configuración usando una válvula de tres vías, o vuelva a conectar el tubo y realice un experimento de prueba durante 5 a 10 minutos. Para grabaciones experimentales más largas, detenga y reinicie rápidamente el programa de seguimiento cada 20 minutos, o los archivos de datos serán demasiado grandes.

Entre las pruebas, deseche las moscas, limpie la arena y las placas de vidrio con etanol al 70% y reemplace los tubos conectores. Mantenga el flujo de aire seco en marcha para lavar continuamente el sistema. Para mayor eficiencia, es bueno tener dos arenas para que la limpieza se pueda realizar durante las carreras.

- Si se realizan varios experimentos el mismo día, preste mucha atención para asegurarse de que no quede olor en el sistema de una ejecución anterior. Normalmente, esto no es un problema con bajas concentraciones de odorante o con CO2. Pero para estímulos altamente concentrados, puede ser necesario un intervalo de hasta 24 horas entre las ejecuciones del experimento.